豬肝細胞與骨髓間充質幹細胞共微囊化內置生物人工肝方法
2023-06-09 07:58:36
專利名稱：豬肝細胞與骨髓間充質幹細胞共微囊化內置生物人工肝方法
技術領域：
本發明涉及一種內置生物人工肝支持系統，特別涉及豬肝細胞與骨髓間充質幹細胞共微囊化內置生物人工肝方法
背景技術：
生物人工肝主要包括外置和內置生物人工肝兩種類型。其基本原理是將體外培養增殖的肝細胞置於循環裝置或者直接置於體內，患者血液/體液通過生物纖維半透膜與培養的肝細胞進行物質交換，從而達到理想的人工肝支持作用。肝細胞是生物人工肝的核心材料，生物人工肝對肝功能衰竭患者的支持作用依賴於所用肝細胞的功能。當前，原代豬肝細胞因其解剖結構、生理特點、合成代謝功能均與人類最為相似，來源豐富，細胞分離技術成熟簡單，故在生物人工肝研究中應用甚廣。隨著免疫隔離技術的飛速發展，由生物材料製成的半透膜如微囊膜可有效阻止免疫細胞、免疫球蛋白和補體的進入，使異種異體細胞構建生物人工肝的免疫排斥問題迎刃而解。內置生物人工肝治療肝功能衰竭的效果主要取決於內置細胞材料的活性狀態和功能表現。在本發明之前，生物人工肝的治療效果並不令人滿意，究其原因系所用肝細胞的活性及功能無法長期高效維持。原代肝細胞是一種高分化細胞，正常生理狀態下處於靜止期，很難分化增殖。成熟肝細胞一旦失去體內生理微環境，在體外傳統培養過程中極易喪失其結構特徵和分化再生能力，呈「去分化」狀態。特別是在進入內穩態紊亂的肝衰患者體內後，內置細胞通常無法長期存活，增殖能力極度有限，嚴重影響移植物對宿主肝功能的支持作用。同時，輸注的肝細胞產生各種促肝再生刺激因子的功能也隨之受到抑制。
發明內容
本發明的目的是為了克服上述缺陷，提供一種豬肝細胞與骨髓間充質幹細胞共微囊化內置生物人工肝裝置。本發明的技術方案如下豬肝細胞與骨髓間充質幹細胞共微囊化內置生物人工肝方法，其主要技術步驟在於(1)建立豬骨髓間充質幹細胞體外培養擴增體系從成年健康實驗用小型豬髂骨抽取骨髓，製備單細胞懸浮液，密度梯度離心後收集單核細胞層，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，隨後放置於37°C、5% CO2培養箱中培養；(2)兩步膠原酶法原位灌注分離豬原代肝細胞將健康豬麻醉成功後外周靜脈全身肝素化，結紮門靜脈和肝下下腔靜脈遠心端， 近側插管分別作為灌注流入道和流出道，阻斷肝上下腔靜脈，使用D-Hanks液灌注肝臟直到血色完全褪去，0. 05%膠原酶緩慢持續原位灌注肝臟，收集肝細胞懸液，臺盼藍拒染試驗計算細胞活力>95% ；(3)藻酸鹽-聚左旋賴氨酸製備微囊包被肝細胞和骨髓間充質幹細胞肝細 胞與骨髓間充質幹細胞混合成單細胞懸液，將上述單細胞懸液懸於2%海藻酸鈉溶液，微囊靜電液滴發生器滴入到lOOmmol/L的CaCl2中，形成海藻酸鈣珠；0. 05%多聚賴氨酸和0. 14%海藻酸鈉分別包裹海藻酸鈣珠，以形成微膠囊；再用lmmol/L檸檬酸鈉液化微膠囊核心。本發明的優點和效果在於將骨髓間充質幹細胞引入內置生物人工肝系統，通過異質細胞間相互作用，包括可溶性細胞因子、細胞功能性接觸以及細胞_細胞外基質作用，充分模擬肝細胞在體微環境，有效延長肝細胞的生存時間，促進肝細胞增殖分化，並保持肝細胞特有的生物學功能，從而顯著改善內置生物人工肝治療肝功能衰竭的治療效果。
圖1——骨髓間充質幹細胞光鏡圖。圖2——骨髓間充質幹細胞流式鑑定圖。圖3——原代肝細胞光鏡圖。圖4——內置生物人工肝細胞材料光鏡圖。圖5——內置生物人工肝細胞材料掃描電鏡圖。圖6——內置生物人工肝細胞材料透射電鏡圖。圖7——內置生物人工肝細胞材料糖原染色圖。圖8——內置生物人工肝細胞材料白蛋白免疫細胞化學染色圖。
具體實施例方式豬骨髓間充質幹細胞體外培養擴增體系的建立從成年健康實驗用小型豬髂骨抽取骨髓組織約5ml，移入離心管中吹打混勻，而後沿管壁按照1 :1體積比緩慢加入含採5ml淋巴細胞分離液的離心管中，採用離心機離心後小心吸取中間雲霧狀細胞層，用磷酸鹽緩衝液洗滌，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基， 隨後放置於37°C、5% CO2培養箱中培養。用單層細胞貼壁培養法棄去未貼壁細胞，胰蛋白酶消化傳代培養，觀察細胞生長情況。豬原代肝細胞的分離純化採用兩步膠原酶原位灌注法分離豬肝細胞。將健康豬麻醉成功後外周靜脈全身肝素化，結紮門靜脈和肝下下腔靜脈遠心端，近側插管分別作為灌注流入道和流出道，阻斷肝上下腔靜脈，使用D-Hanks液灌注肝臟直到血色完全褪去，0. 05%膠原酶緩慢持續原位灌注肝臟，收集肝細胞懸液，臺盼藍拒染試驗計算細胞活力> 95%者符合要求。細胞計數板計算細胞濃度。內置生物人工肝的製作每5 X IO6個肝細胞與2. 5 X IO6個骨髓間充質幹細胞混合成單細胞懸液，將上述細胞懸於2%海藻酸鈉溶液，微囊靜電液滴發生器滴入到lOOmmol/L的CaCl2中，形成海藻酸鈣珠；0. 05%多聚賴氨酸和0. 14%海藻酸鈉分別包裹海藻酸鈣珠，以形成微膠囊；再用 lmmol/L檸檬酸鈉液化微膠囊核心。將上述製備的微囊，0. 9%氯化鈉溶液洗滌2_5次後加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，隨後放置於37°C、5% CO2培養箱中培養，每3天換液。 當需要使用來治療肝功能衰竭時，收集上述培養的微囊用0. 9%氯化鈉溶液洗滌2-5次後植入受體腹腔內，即完成內置生物人工肝的製作。本發明 構建的豬肝細胞與骨髓間充質幹細胞共微囊化內置生物人工肝，其肝細胞形態與功能均較傳統單純肝細胞組建的生物人工肝有顯著改善，下述多種檢測結果足以表明完全符合治療肝功能衰竭的要求一、骨髓間充質幹細胞的鑑定(1)倒置顯微鏡觀察200倍鏡下觀察發現貼壁細胞高度均一，外觀呈梭形或纖維狀，分布均勻，雜質細胞極少(見圖1)。(2)流式細胞儀檢測培養細胞胰酶消化，PBS洗滌3次，加入螢光標記的⑶29、 ⑶44、⑶45和⑶90抗體。室溫下避光孵育15分鐘，PBS洗去未標記抗體，應用FACScan流式細胞儀檢測細胞表面抗原的表達。檢測結果表明⑶29+CD45—、⑶44+^45—、⑶90+CD45—細胞比例均大於95%，證明細胞為非造血組織來源(見圖2)。二、原代豬肝細胞的鑑定(1)倒置顯微鏡觀察200倍鏡下觀察發現肝細胞貼壁良好，形態不規則，呈多角形，胞體變平伸展(見圖3)。(2)臺盼蘭染色按照1 1體積比將肝細胞懸液與臺盼蘭染液混勻，100倍鏡下計算胞核未藍染的細胞比例大於95%。三、內置生物人工肝細胞材料的形態學檢測(1)倒置顯微鏡觀察200倍鏡下觀察發現肝細胞緊密黏附於骨髓間充質幹細胞表面，幾個至十幾個肝細胞呈團聚性生長(見圖4)。(2)掃描電鏡觀察3%戊二醛4°C固定過夜，依次置於30%、50%、70%、80%、 90%、95%、100%的乙醇溶液中脫水，掃描電鏡下觀察發現肝細胞形態完整，成團黏附於骨髓間充質幹細胞表面，肝臟細胞間以及肝細胞與骨髓間充質幹細胞間有大量細胞外基質存在(見圖5)。(3)透射電鏡觀察3%戊二醛4°C固定過夜，PBS清洗2次。4°C避光條件下用
鋨酸固定2小時，雙蒸水衝洗。依次置於30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液中脫水，包埋製作超薄切片，乙酸雙鈾及檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察發現內置生物人工肝細胞材料與單純培養肝細胞相比較，細胞膜結構完整，胞內的線粒體和內質網極少萎縮或空泡化，細胞核清晰可見，異質細胞間見緊密連接形成(見圖6)。四、內置生物人工肝細胞材料的功能學檢測(1)糖原染色4%多聚甲醛固定20分鐘，過碘酸氧化5分鐘，蒸餾水漂洗3次， 希夫試劑處理15分鐘，蒸餾水洗10分鐘，蘇木精染色1分鐘，蒸餾水漂洗，常規脫水，中性樹膠封片。結果顯示內置生物人工肝細胞材料糖原染色呈強陽性，提示肝細胞合成糖原功能增強(見圖7)。(2)白蛋白免疫細胞化學染色4%多聚甲醛固定20分鐘，蒸餾水衝洗，3% H2O2室溫孵育5分鐘，一抗工作液37°C孵育1小時，PBS衝洗後二抗37°C孵育半小時，DAB顯色，中性樹膠封片。鏡下觀察發現肝細胞內白蛋白染色呈強陽性，提示該內置生物人工肝細胞材料合成白蛋白功能顯著改善(見圖8)。
綜上所述，用 豬肝細胞與骨髓間充質幹細胞共微囊化構建的內置生物人工肝符合治療肝功能衰竭的要求。
權利要求
1.豬肝細胞與骨髓間充質幹細胞共微囊化內置生物人工肝方法，其步驟在於(1)建立豬骨髓間充質幹細胞體外培養擴增體系從成年健康實驗用小型豬髂骨抽取骨髓，製備單細胞懸浮液，密度梯度離心後收集單核細胞層，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，隨後放置於37°C、5% CO2培養箱中培養；(2)兩步膠原酶法原位灌注分離豬原代肝細胞將健康豬麻醉成功後外周靜脈全身肝素化，結紮門靜脈和肝下下腔靜脈遠心端，近側插管分別作為灌注流入道和流出道，阻斷肝上下腔靜脈，使用D-Hanks液灌注肝臟直到血色完全褪去，0. 05%膠原酶緩慢持續原位灌注肝臟，收集肝細胞懸液，臺盼藍拒染試驗計算細胞活力> 95% ；(3)藻酸鹽-聚左旋賴氨酸製備微囊包被肝細胞和骨髓間充質幹細胞肝細胞與骨髓間充質幹細胞混合成單細胞懸液，將上述單細胞懸液懸於2%海藻酸鈉溶液，微囊靜電液滴發生器滴入到lOOmmol/L的CaCl2中，形成海藻酸鈣珠；0. 05%多聚賴氨酸和0. 14%海藻酸鈉分別包裹海藻酸鈣珠，以形成微膠囊；再用lmmol/L檸檬酸鈉液化微膠囊核心。
2.根據權利要求1中所述的豬肝細胞與骨髓間充質幹細胞共微囊化內置生物人工肝方法，其特徵在於步驟(3)中控制截流量為小於110KD，微囊內細胞密度IO6個細胞/ml。
3.根據權利要求1中所述的豬肝細胞與骨髓間充質幹細胞共微囊化內置生物人工肝方法，其特徵在於步驟(3)中肝細胞與骨髓間充質幹細胞的比例為2 1。
全文摘要
本發明涉及一種豬肝細胞與骨髓間充質幹細胞共微囊化內置生物人工肝方法。本發明先建立豬骨髓間充質幹細胞體外培養擴增體系，再採用兩步膠原酶法原位灌注分離豬原代肝細胞，然後藻酸鹽-聚左旋賴氨酸製備微囊包被肝細胞和骨髓間充質幹細胞。本發明克服了內置細胞通常無法長期存活，增殖能力極度有限，輸注的肝細胞產生各種促肝再生刺激因子的功能也隨之受到抑制等缺陷。本發明將骨髓間充質幹細胞引入內置生物人工肝系統，通過異質細胞間相互作用，充分模擬肝細胞在體微環境，有效延長肝細胞的生存時間，促進肝細胞增殖分化，並保持肝細胞特有的生物學功能，從而顯著改善內置生物人工肝治療肝功能衰竭的治療效果。
文檔編號C12N5/071GK102218161SQ201010591170
公開日2011年10月19日 申請日期2010年12月16日 優先權日2010年12月16日
發明者丁義濤, 施曉雷, 顧勁揚 申請人:南京大學醫學院附屬鼓樓醫院