將煙囪頂96孔pcr板用於批量測定胺基酸含量的方法

2023-06-09 01:54:11 4

專利名稱：將煙囪頂96孔pcr板用於批量測定胺基酸含量的方法
技術領域：
本發明屬於分析化學領域，具體涉及一種將煙囪頂96孔PCR板用於茚三酮比色法批量測定樣品中胺基酸含量的方法。
背景技術：
胺基酸與茚三酮在加熱條件下的反應是一種可定量的顯色反應。反應產物所呈現的顏色隨胺基酸、酸鹼度、溫度、還原劑和金屬離子強度等的不同而異。多數胺基酸與茚三酮反應產生藍紫色化合物，該化合物顏色的深淺與胺基酸的含量成正比，通過測定該顯色化合物在其吸收峰(通常在570nm)的吸光度，可以測定胺基酸的含量。茚三酮比色法簡便可靠而被廣泛地應用於檢測食品、飲品、調味品和保健品中的胺基酸含量。當前質檢部門需要檢測大量樣品，常規的茚三酮比色法進行茚三酮反應是將樣品溶液與茚三酮試劑放在玻璃試管中用沸水加熱，這種操作方式不易同時檢測大量樣品。通常，將常規比色法批量化來檢測樣品中某物質的含量是將微量體積的樣品溶液和顯色劑溶液加入96孔微孔板的小孔中進行顯色反應，用酶標儀檢測各孔中顯色產物的吸光度，但這種方式並不適用於需要沸水加熱的茚三酮反應。常規的透明微孔板的材質是不耐熱的聚苯乙烯，在沸水中會變形。一般耐熱的聚丙烯材質的塑料製品透明度差，不能滿足檢測孔內溶液吸光度的要求。最近已有製造商，如德國Eppendorf公司，用聚丙烯製成了高透明的微孔板(目前的價格約是常規聚苯乙烯微孔板的兩倍)，能夠用來檢測孔內溶液的吸光度；但其整個底部與常規的微孔板一樣是平的，當用沸水加熱時，板周邊孔的底部和板邊緣側面可同時受熱，而內部的孔僅底部受熱，導致周邊與內部孔內的溶液在受熱、顯色速率和蒸發量上都有差異，結果同樣的樣品溶液經反應後在周邊孔和內部孔的吸光度不同，產生較大的檢測誤差。而且，沸水有時會進入微孔內幹擾比色測定。另外，用已預熱的可精確控溫的烘箱能均勻加熱耐熱的微孔板，但為了防止溶液在烘烤下蒸發，需要在反應液上覆蓋一層不參與反應且透明的油(Efewmonkiekie W. Iyamu, Toshio Asakura, Gerald Μ. Woods. Analytical Biochemistry 2008,383 :332-334)，在操作上不夠簡便。因此，目前還欠缺簡便、可靠且實用的能用茚三酮比色法批量檢測樣品中胺基酸含量的方法。

發明內容
本發明要解決的技術問題是，提供一種簡便可靠的、將聚丙烯材質的煙囪頂96孔 PCR板用於茚三酮比色法批量測定樣品中胺基酸含量的方法。本發明的解決方案是，提供一種將聚丙烯材質的煙囪頂96孔PCR板用於批量測定胺基酸含量的方法該方法通過茚三酮比色法測定樣品溶液中的胺基酸含量，將煙囪頂 96孔PCR板上的各小管作為盛裝樣品溶液和茚三酮試劑的容器，用鏤空的乙烯乙酸乙烯酯 (EVA)塑料墊(俗稱「水漂」)架著浮在沸水中加熱進行茚三酮反應，在顯色完全後將小管中的反應液轉入聚苯乙烯材質的96孔微孔板的板孔中，再用全波長酶標儀在顯色物的吸收峰(通常在570nm)測定吸光度來測定樣品液中胺基酸的含量。本發明中，所述聚丙烯材質的煙囪頂96孔PCR板在結構上是一個平板嵌著縱8X 橫12個錐形小管；每個小管中下部垂直凸出在板平面下方，而頂端高出板平面約5mm;平板在由小管組成的矩陣陣列外有一周邊沿(見圖1)；板的邊沿可用EVA塑料墊架著使板浮在沸水上，各錐形小管在板平面下的凸出部分可浸入水中均勻受熱，高出板平面的「煙囪頂」 不僅能部分減少各小管內溶液的蒸發，免去在反應液上覆油來阻止蒸發，而且能防止沸水進入小管內。本發明中，用乙二醇作茚三酮的溶劑並添加抗壞血酸還原劑，這些物質無毒且有效地穩定了茚三酮和顯色產物，並防止還原茚三酮被氧化，提高了檢測的可重複性。本發明中，所述聚丙烯材質的煙囪頂96孔PCR板是分子生物學研究和診斷中用來擴增核酸片段的聚合酶鏈式反應(PCR)所用的一種特殊的批量反應容器；煙囪頂的特殊設計主要用來防止PCR擴增核酸片段時各管孔間樣品的交叉汙染。本發明利用分子生物學中批量擴增核酸的PCR反應容器的特性，創新性地將煙囪頂96孔PCR板用於批量進行分析化學中的茚三酮反應，解決了用沸水或烘箱直接加熱微孔板時遇到的問題或不便，建立了用茚三酮比色法批量測定樣品中胺基酸含量的新方法。本發明的有益效果在於本發明提供的將聚丙烯煙囪頂96孔PCR板用於茚三酮比色法批量測定樣品中胺基酸含量的方法，在檢測準確度、靈敏度和可重複性上與常規的茚三酮比色法相同，但比常規茚三酮比色法操作更簡便，節省了人力、時間及試劑的用量，可廣泛應用於批量檢測食品、飲品、調味品和保健品中胺基酸的含量。同時，本發明將分子生物學研究和診斷中用來批量擴增核酸的煙囪頂PCR板用於分析化學的茚三酮比色測定，為煙囪頂PCR板提供了一種全新的用途。


圖1為煙囪頂96孔PCR板的示意圖。(圖中的A_H、1_12表示各小管位置序號)圖2為本發明方法用煙囪頂96孔PCR板作茚三酮反應容器測定L-穀氨酸濃度的標準曲線。圖3為常規方法用玻璃試管作茚三酮反應容器測定L-穀氨酸濃度的標準曲線。
具體實施例方式本發明用聚丙烯煙囪頂96孔PCR板的小管作反應容器，用鏤空的EVA塑料墊將 PCR板浮在沸水上，加熱小管中的樣品和茚三酮試劑進行顯色反應，在顯色完全後將小管中的反應液轉入聚苯乙烯材質的96孔微孔板的板孔中，再用全波長酶標儀在顯色物的吸收峰(通常在570nm)測定吸光度來測定樣品液中胺基酸的含量。當空白、7個工作濃度標準樣和樣品各設三個重複，一個煙囪頂96孔PCR板可以同時測定M個樣品，實現了批量檢測樣品中胺基酸的含量。而且，本發明在配製茚三酮溶液時用乙二醇作溶劑穩定茚三酮和顯色產物，並加了抗壞血酸作還原劑來防止還原茚三酮被氧化；配製時每克茚三酮用120ml 乙二醇溶解並加30mg抗壞血酸。
實施例所需儀器有精密電子天平、單道移液器、8道移液器、電磁爐及配套用鍋、721型可見光分光光度計、全波長酶標儀或可檢測微孔板樣品的分光光度計。所需其它材料有容量瓶、試管、三角瓶、移液槽、EVA塑料墊、煙@頂96孔PCR板和96孔微孔板。配製茚三酮溶液稱取l.Og茚三酮和30mg抗壞血酸溶解於120ml乙二醇， 在-20°C保存。配製檸檬酸緩衝液稱取19. 21g無水檸檬酸溶解於雙蒸水，定容至IOOml配成IM 檸檬酸溶液；稱取29. 41g 二水合檸檬酸三鈉溶解於雙蒸水，定容至IOOml配成檸檬酸鈉溶液。分別取配比的檸檬酸和檸檬酸鈉溶液混合成適合特定胺基酸進行茚三酮反應的最適PH 值的IM檸檬酸緩衝液。如對於L-穀氨酸進行茚三酮反應，用41ml檸檬酸溶液和59ml檸檬酸鈉溶液混合成100ml pH 5. 0的IM檸檬酸緩衝液。配製胺基酸標準溶液稱取胺基酸標準品溶於雙蒸水並定容成胺基酸母液，再用雙蒸水稀釋到胺基酸標準曲線製作工作濃度。以L-穀氨酸為例，稱取73. 6mg L-穀氨酸溶解於雙蒸水定容至IOOml配成5mM L-穀氨酸母液，再吸取5ml用雙蒸水稀釋10倍得到50ml 0. 5mM的L-穀氨酸標準液，再分別吸取8. 0、6. 0、4. 0、2. 0、1. 0和0. 5ml的0. 5mM L-穀氨酸標準液，用雙蒸水稀釋定容到10ml，配成0. 4,0. 3,0. 2,0. 1,0. 05和0. 025mM的L-穀氨酸系列標準液。用煙囪頂96孔PCR板作茚三酮反應容器製作胺基酸濃度測定標準曲線和測定樣品液中胺基酸的濃度或含量用單道移液器在煙囪頂96孔PCR板的小管中分別加入60 μ 1 的雙蒸水、胺基酸系列標準液(如0. 025,0. 05、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4和0. 5mM 7個濃度的L-穀氨酸系列標準液)和樣品液，各3個重複；將IOml茚三酮溶液和IOml IM檸檬酸緩衝液混勻倒入移液槽，用8道移液器吸取120 μ 1的茚三酮試劑加入96孔PCR板的每個小管，並在小管中吸排溶液幾次混勻反應液；用鏤空的EVA塑料墊架著96孔PCR板浮在沸水上加熱， 顯色完全(如檢測L-穀氨酸需加熱15分鐘)後，將96孔PCR板從沸水中取出放在室溫水浴上冷卻2分鐘；用8道移液器吸取100 μ 1各反應液加入96孔微孔板的相應孔中，用全波長酶標儀在顯色物的吸收峰(通常在570nm)測定吸光度，通過胺基酸系列標準液反應液的吸光度製作標準曲線並計算出回歸方程和相關係數，利用回歸方程來計算測定樣品液中胺基酸的含量。按常規方法用玻璃試管作茚三酮反應容器製作胺基酸濃度測定標準曲線和測定樣品液中胺基酸的濃度或含量用單道移液器在玻璃試管(直徑18mm，長度180mm)中分別加入Iml的雙蒸水、胺基酸系列標準液(如0. 025,0. 05、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4和0. 5mM 7個濃度的L-穀氨酸系列標準液)和樣品液，各3個重複；將IOOml茚三酮溶液和100ml IM檸檬酸緩衝液倒入玻璃三角瓶中混勻，用單道移液器吸取2ml茚三酮試劑加入每個玻璃試管； 給試管加蓋後振蕩幾次混勻反應液，將試管放在沸水中加熱；顯色完全(如檢測L-穀氨酸需加熱15分鐘)後，將試管從沸水中取出放在室溫水浴中冷卻2分鐘；將試管中冷卻的反應液振蕩幾次再靜置10分鐘後，將試管中的反應液倒入比色皿中，用721型分光光度計在顯色物的吸收峰(通常在570nm)測定吸光度，通過胺基酸系列標準液反應液的吸光度製作標準曲線並計算出回歸方程和相關係數，利用回歸方程來計算測定樣品液中胺基酸的含量。
比較用煙囪頂96孔PCR板作茚三酮反應容器和常規方法用玻璃試管作茚三酮反應容器製作L-穀氨酸濃度測定標準曲線發現兩種方法都獲得了線性的標準曲線，所得回歸方程分別為y = 3. 0585x(圖2)和y = 3. 4074x(圖3)，相關係數R2都達到0. 999 ；兩種方法檢測L-穀氨酸濃度的下限都是0. 0125mM ；表明本發明方法在檢測準確度、靈敏度和可重複性上與常規的茚三酮比色法相同。但是，如果用常規茚三酮比色法檢測M個樣品中的穀氨酸，每個樣品三個重複，製作標準曲線要用M個試管，檢測M個樣品要用72個試管；如果再用常規電磁爐和配套用鍋來進行沸水浴加熱，一個人要分四次加熱反應才能檢測完，費時費力，消耗的茚三酮試劑和檸檬酸緩衝液至少是用煙囪頂96孔PCR板反應的10 倍。而用本發明方法的煙囪頂PCR板進行茚三酮反應，一個板一次反應就可同時完成標準曲線的製作和M個樣品的檢測，省時、省力、省試劑。
權利要求
1.將煙囪頂96孔PCR板用於批量測定胺基酸含量的方法，是通過茚三酮比色法測定樣品溶液中的胺基酸含量；其特徵在於，在測定過程中，使用聚丙烯材質的煙囪頂96孔PCR 板上的各小管作為盛裝樣品溶液和茚三酮試劑的容器，用鏤空的乙烯乙酸乙烯酯塑料墊架著PCR板浮在沸水中加熱進行茚三酮反應；在配製茚三酮溶液時，使用乙二醇作為溶劑以穩定茚三酮及顯色產物，並添加抗壞血酸作為還原劑以防止茚三酮被氧化。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的煙囪頂96孔PCR板是一個嵌有縱 8X橫12個錐形小管的平板，能批量盛裝微量體積溶液進行化學反應；板的材質是耐熱的聚丙烯，能用沸水加熱小管中的溶液進行化學反應；在由小管組成的矩陣陣列外有一周邊沿，能用鏤空的EVA塑料墊架著使板浮在沸水上；各小管中下部垂直凸出板平面下方，凸出部分能浸入水中均勻受熱；各小管頂端高出板平面5mm，高出的管壁部分能在加熱時減少小管內溶液的蒸發，而且能防止沸水進入小管內。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，茚三酮溶液的配比為每克茚三酮用 120ml乙二醇溶解並添加30mg抗壞血酸。
全文摘要
本發明屬於分析化學領域，旨在提供一種將煙囪頂96孔PCR板用於批量測定胺基酸含量的方法。該方法是通過茚三酮比色法測定樣品溶液中的胺基酸含量，在測定過程中使用聚丙烯材質的煙囪頂96孔PCR板上的各小管作為盛裝樣品溶液和茚三酮試劑的容器，用鏤空的乙烯乙酸乙烯酯塑料墊架著PCR板浮在沸水中加熱進行茚三酮反應。本發明比常規茚三酮比色法操作更簡便，節省了人力、時間及試劑的用量，可廣泛應用於批量檢測食品、飲品、調味品和保健品中胺基酸的含量。同時，本發明將分子生物學研究和診斷中用來批量擴增核酸的煙囪頂PCR板用於分析化學的茚三酮比色測定，為煙囪頂PCR板提供了一種全新的用途。
文檔編號G01N21/78GK102323259SQ20111016493
公開日2012年1月18日 申請日期2011年6月19日 優先權日2011年6月19日
發明者安千裡, 李鄭義 申請人:浙江大學