一種植物微生物聯修復重金屬汙染土壤的方法與流程
2023-06-01 18:51:11
本發明涉及土壤修復領域，具體地涉及一種植物微生物聯修復重金屬汙染土壤的方法。
背景技術：
土壤重金屬汙染具有汙染物在土壤中移動性差、滯留時間長、自然降解慢的特點，並可經水、植物等介質最終影響人類健康。歷史上發生的「骨痛病」和「水俁病」就是由於重金屬汙染而致病的典型案例。鎳汙染是由鎳或其化合物所引起的環境汙染，鎳元素可以在土壤中富集，土壤中的鎳主要來源於大氣降塵、含鎳廢水、農田施肥、植物和動物殘體的腐爛等。含鎳化合物有潛在致癌風險，並對農作物生長有一定抑制作用。
日前針對土壤重金屬汙染的修複方法主要有物理修復、化學修復、農業生態修復等。物理修復主要包括電動修復以及電熱修復，化學修復主要為土壤熱淋，由於物理修復及化學修複方法均有一定缺陷，植物修復及植物-微生物聯合修復成為重金屬汙染土壤修複方法的研究熱點。
植物根分泌物包括溢泌物、分泌物、粘膠質、分解物和脫落物，從組分上包括各種糖類、有機酸和胺基酸等。根分泌物主要通過改變根際環境ph值和氧化還原電位以及重金屬的化學性質，改變汙染土壤中金屬元素的形態和活性或者鰲合、吸附、包埋根際中某些游離重金屬離子，降低重金屬汙染物在土壤中的流動性。
本發明提供一種植物與微生物聯合修復系統，通過所選植物與微生物複合菌劑的相互配合，組成穩定的生態修復系統，利用牧草及其根際環境微生物體系的吸收、轉化的作用，能夠有效降解或富集汙染土壤中的鎳，實現對土壤的有效修復。
技術實現要素：
為了解決上述技術問題，本發明提供一種植物微生物聯修復重金屬汙染土壤的方法。
本發明是以如下技術方案實現的：
為實現上述目的，本發明提供一種植物微生物聯合修復土壤汙染的方法，所述方法包括在鎳汙染土壤上種植牧草，像牧草根部注射複合微生物菌劑。
進一步地，所述方法包括：
步驟1、在鎳汙染土壤上種植牧草，所述牧草優選地為黑麥草；
步驟2、向黑麥草根部均勻注射所述複合微生物菌劑，待黑麥草生長的平均株高距地面5～8cm後，再次向黑麥草土壤際根注射複合微生物菌劑；
步驟3、所述複合微生物菌劑中各菌種的接種量以百分比計為：球形紅細菌4.5％，類黃氫噬胞菌10％，中華屈撓桿菌6.7％，脫硫弧菌9％，小單孢菌2％、木薯菌1.5％、假單胞菌3.2％。
步驟4、所述複合微生物菌劑的製備步驟為：將球形紅細菌、類黃氫噬胞菌、中華屈撓桿菌、脫硫弧菌、小單孢菌、木薯菌、假單胞菌分別進行振蕩培養，將上述菌株接種到液體培養基中，28℃振蕩培養對數生長期，將菌液轉移至無菌離心瓶中離心，收集菌體，並用去離子水反覆清洗，最終將離心出的菌體用無菌去離子水洗淨後稀釋至od600≈1.0，將菌體按照微生物複合菌的配比方式進行混合，得到複合微生物菌劑。
更進一步地，所述複合微生物菌劑中各菌種的接種量以百分比計為：球形紅細菌15.5％、類黃氫噬胞菌9％、中華屈撓桿菌3.1％、脫硫弧菌5％、小單孢菌1.5％、木薯菌8.5％、假單胞菌2.5％。
進一步地，所述菌種按照以下方法活化：
步驟1、安瓿管開封：用浸過70％酒精的脫脂棉擦淨安瓿管；用火焰將安瓿管頂端加熱；滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂；用銼刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。
步驟2、菌株恢復培養：用無菌吸管，吸取0.3-0.4ml適宜的液體培養基，滴入安瓿管內，輕輕振蕩，使凍幹菌體溶解呈懸浮狀；取約0.2ml菌體懸浮液，移植於指定的瓊脂斜面培養基上，剩餘的菌液，注入指定的液體培養基內(3-4ml)，然後在建議的溫度下培養。
步驟3、注意事項：菌種活化前，請將安瓿管保存在5-10℃的環境下；厭氧菌的培養，如無特別說明，自開封至接種完成，均需以無氧氣體充填，以保持厭氧狀態；某些菌種經過冷凍乾燥保存後，延遲期較長，需連續兩次繼代培養才能正常生長。
優選地，所述牧草選自麥草、冬牧、黑麥草、苦蕒菜、白三葉、雞腳草、菊苣、魯梅克斯、紫花苜蓿、蕪菁甘藍。
本發明的有益效果是：
本發明提供一種植物-微生物聯修復重金屬汙染土壤的方法，通過所選植物與複合微生物菌劑的相互配合，組成穩定的生態修復系統，利用牧草及其根際環境微生物體系的吸收、轉化的作用，有效降解和富集汙染土壤中的鎳，以實現對土壤的有效修復。
附圖說明
圖1是黑麥草與複合微生物菌劑降解土壤鎳汙染示意圖。
具體實施方式
為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步地詳細描述。
實施例1：具有降解功能的微生物的選取
球形紅細菌rhodobactersphaeroides屬於光合細菌紫色非硫菌群的紅細菌屬，球形紅細菌是具有原始光能合成體系的原核微生物，兼性厭氧細菌，可以隨著生存環境靈活地改變代謝類型，中國普通微生物菌種保藏管理中心可以提供，購買號cgmcc.14736。
類黃氫噬胞菌hydrogenophagaflava產生非水溶性黃色素，好氧，兼性嗜氫自養菌，以氧為末端電子受體的氧化型的糖代謝，具有厭氧硝酸鹽呼吸，具反硝化作用。能在含有機酸、胺基酸或蛋白腖的培養基上良好生長，但很少利用碳水化合物，中國普通微生物菌種保藏管理中心可以提供，購買號cgmcc.58473。
中華屈撓桿菌flexibacterchinenses，細胞有時聚集成團，兼性厭氧，革蘭氏陰性，無內生芽孢及其它形式的休眠細胞，滑行運動，能利用多種糖類作為碳源但不分解瓊脂、幾丁質和纖維素。對固氮藍藻營養細胞有溶解能力。對四環素以外的多種抗菌素均具有相當強的耐受性，模式株fca中國科學院水生生物研究所可提供，購買號cgmcc.75673。
脫硫弧菌desulfovibriodesulfuricans，革蘭氏陰性，專性厭氧，不產芽孢，彎曲或螺旋杆狀。存在於土壤中，可還原態硫化物進行厭氧呼吸。中國普通微生物菌種保藏管理中心可以提供，購買號cgmcc.36984。
除上述細菌外，還添加小單孢菌、木薯菌、假單胞菌(市售菌株)。
實施例2：微生物複合菌劑的製備
用下列方法恢復培養cgmcc冷凍乾燥的菌種：
a.安瓿管開封：用浸過70％酒精的脫脂棉擦淨安瓿管；用火焰將安瓿管頂端加熱；滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂；用銼刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。
b.菌株恢復培養：用無菌吸管，吸取0.3-0.4ml適宜的液體培養基，滴入安瓿管內，輕輕振蕩，使凍幹菌體溶解呈懸浮狀；取約0.2ml菌體懸浮液，移植於指定的瓊脂斜面培養基上，剩餘的菌液，注入指定的液體培養基內(3-4ml)，然後在建議的溫度下培養。
c.注意事項：菌種活化前，請將安瓿管保存在5-10℃的環境下；厭氧菌的培養，如無特別說明，自開封至接種完成，均需以無氧氣體充填，以保持厭氧狀態；某些菌種經過冷凍乾燥保存後，延遲期較長，需連續兩次繼代培養才能正常生長。
所述微生物複合菌劑中各菌種的接種量以百分比計為：球形紅細菌4.5％，類黃氫噬胞菌10％、中華屈撓桿菌6.7％、脫硫弧菌9％、小單孢菌2％、木薯菌1.5％、假單胞菌3.2％，餘量由生理鹽水或lb液體培養基補足。或所述微生物複合菌中各菌種的接種量以百分比計為：球形紅細菌15.5％、類黃氫噬胞菌9％、中華屈撓桿菌3.1％、脫硫弧菌5％、小單孢菌1.5％、木薯菌8.5％、假單胞菌2.5％，餘量由生理鹽水或lb液體培養基補足。
將上述菌種分別進行振蕩培養，菌株接種到液體培養基中，28℃振蕩培養對數生長期，將菌液轉移至無菌離心瓶中離心，收集菌體，並用去離子水反覆清洗，最終將離心出的菌體用無菌去離子水洗淨後稀釋至od600≈1.0，將菌體按照複合微生物菌的配比方式進行混合，得到複合微生物菌劑。
實施例3：植物-微生物降解系統的構建
在鎳汙染土壤中播種黑麥草，待黑麥草出苗後，向黑麥草根部均勻注射實施例1所述複合菌微生物菌劑，待牧草生長的平均株高距地面5～8cm後，再次向土壤際根均勻注射複合微生物菌劑(採用五點法分孔注射微生物複合菌)。通過牧草與微生物複合菌的聯合作用，實現對鎳汙染土壤的修復工作。微生物群落可以加強牧草對環境脅迫的抗性，提高黑麥草的生物量，同時還能通過生理代謝產生小分子物質來活化土壤中重金屬，提高重金屬的生物有效性，而黑麥草可以分泌營養物質或小分子物質促進微生物生長，從而使得植物-微生物系統聯合修復土壤重金屬汙染效果顯著提升。
實施例4：植物-微生物降解系統的降解效果檢測
取放置有鎳汙染土壤1000g的花盆10個，編號為q1-q9號，剩餘一個為ck，檢測初始鎳濃度並記錄，向花盆中分別接種黑麥草5株，q1-q9號盆按實施例2所述方法注射複合微生物菌劑，培養90天，第30天檢測q1-q3號盆的鎳濃度，取平均值；第60檢測q4-q6號盆的鎳濃度，取平均值；第90檢測q7-q9號盆的鎳濃度，取平均值；檢測結果如表1及圖1所示，檢測結果表明，黑麥草與複合微生物菌劑的聯合使用可以有效降解或富集土壤中的鎳元素。
表1黑麥草與複合微生物菌劑降解效果測試結果
以上所揭露的僅為本發明較佳實施例而已，當然不能以此來限定本發明之權利範圍，因此依本發明權利要求所作的等同變化，仍屬本發明所涵蓋的範圍。