紫外輻照滅活血紅蛋白及血紅蛋白氧載體中病毒的方法

2023-06-02 02:17:06

紫外輻照滅活血紅蛋白及血紅蛋白氧載體中病毒的方法
【專利摘要】本發明提供一種人源或動物源的血紅蛋白及血紅蛋白氧載體的病毒滅活方法，從而將其可能含有的病毒部分或全部去除。待處理的血紅蛋白或血紅蛋白氧載體為溶液形態；該方法包括以下步驟：先用性質較為惰性的氣體將氧合血紅蛋白進行脫氧，使之轉化為脫氧血紅蛋白，防止亞鐵血紅蛋白的氧化，再用紫外燈對脫氧血紅蛋白溶液進行照射，設置照射至液面時的紫外線強度為50—110μw/cm2，並根據照射面積及溶液體積調整照射時間，照射完成後即完成了病毒滅活的過程。
【專利說明】紫外輻照滅活血紅蛋白及血紅蛋白氧載體中病毒的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物製品【技術領域】,具體涉及以血紅蛋白(hemoglobin, Hb)為原料製備生物製品時病毒滅活的方法。
【背景技術】
[0002]用人或者動物的血紅蛋白製備生物製品，為防止病毒的交叉感染，其生產工藝須具備一定的去除/滅活部分病毒能力，將其可能含有的病毒部分或全部去除。
[0003]由於不同生物製品潛在的病毒種類不同，所選擇病毒去除/滅活方法的側重點也應有所不同，故而有多種去除/滅活的方法。根據生物我國生物製品《血液製品去除/滅活病毒技術方法及驗證指導原則》，常用的方法有:(1)巴斯德消毒法(巴氏消毒法)#)乾熱法(凍幹製品)；⑶有機溶劑/去汙劑(S/D)處理法；⑷膜過濾法；(5)低pH孵放法；(6)化學滅活方法。
[0004]無基質血紅蛋白(stroma-free hemoglobin, SFH)具有攜氧釋氧的能力，一直以來被作為氧載體製劑進行研究代替紅細胞的功能，具有潛在的臨床應用價值，由人或動物血紅蛋白開發出來的代替紅細胞攜氧釋氧功能的製劑被稱為血紅蛋白氧載體(Hemoglobin-based oxygen carriers, HBOCs)。這種製劑主要通過穩定血紅蛋白四聚體並增加分子量或是分子半徑的手段來克服天然血紅蛋白的缺陷。目前開發的產品主要有四類:(I)聚合血紅蛋白；(2)共軛血紅蛋白；(3)分子內交聯血紅蛋白；(4)重組人血紅蛋白。
[0005]在哺乳動物中，血紅蛋白在天然狀態下，它由兩對亞基組成(2α β)，是一個四聚體的蛋白結構，分子量約為 64，000道爾頓，每個亞基上有一個鐵卟啉，當鐵元素處於II價時，血紅蛋白具有攜氧釋氧的能力，稱為亞鐵血紅蛋白，結合了氧的血紅蛋白稱為氧合血紅蛋白，未結合氧的亞鐵血紅蛋白稱為脫氧血紅蛋白；當鐵元素處於III價時，鐵元素被氧化，血紅蛋白不具有攜氧釋氧的能力，稱為高鐵血紅蛋白。血紅蛋白氧載體必須使血紅蛋白處於亞鐵血紅蛋白蛋白時才具有攜氧釋氧的功能。
[0006]亞鐵血紅蛋白非常容易被氧化成高鐵血紅蛋白，特別在氧合狀態下會被紫外線快速氧化，因此，本領域技術人員從未考慮直接用紫外線照射的方式對血紅蛋白及由其為原料的血紅蛋白氧載體進行病毒滅活。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種人源或動物源的血紅蛋白及血紅蛋白氧載體的病毒滅活方法，從而將其可能含有的病毒部分或全部去除。
[0008]本發明的基本解決方案如下:
[0009]待處理的血紅蛋白或血紅蛋白氧載體為溶液形態；該方法是先用性質較為惰性的氣體(常溫常壓下不溶於水且不與血紅蛋白反應的氣體)將氧合血紅蛋白進行脫氧，使之轉化為脫氧血紅蛋白，防止亞鐵血紅蛋白的氧化，再用紫外燈對脫氧血紅蛋白溶液進行照射，設置照射至液面時的紫外線強度為50 —110 μ w/cm2,並根據照射面積及溶液體積調整照射時間，照射完成後即完成了病毒滅活的過程。
[0010]具體的方案如下:
[0011]步驟1:取一密閉容器，在該容器中加入血紅蛋白或者血紅蛋白氧載體溶液並進行攪拌，將容器連接氣體交換膜，液相一側接通溶液，氣相一側連接惰性的氣體，對血紅蛋白或血紅蛋白氧載體進行脫氧，在溶液上方同時也通入惰性的氣體，將溶液上方的空氣排出，或者僅在溶液上方連續通入惰性的氣體以降低氧分壓使血紅蛋白脫氧；直至脫氧血紅蛋白大於90%時，撤去氣體交換膜，並在溶液上方繼續通入惰性的氣體，或停止通入惰性的氣體但需封閉容器通氣口以阻止與外界大氣交換；上述惰性的氣體可以是氮氣、氦氣、氖氣、IS氣、氣氣、氡氣、氫氣等；
[0012]步驟2:該容器裝有石英玻璃窗口，將紫外燈置於石英玻璃窗口前，打開紫外燈調整距離，使紫外線透過該石英玻璃窗口照射於液面時的強度為50 —110 μ w/cm2，照射時間根據液體厚度調整，每1.0cm厚度增加大於1.4天照射時間，總厚度不超過20cm ;照射完畢後收集得到的溶液即為滅活病毒後的血紅蛋白或者血紅蛋白氧載體溶液。
[0013]以上具體方案中，應當注意兩點:
[0014]一、紫外線照射強度需在50 —110 μ w/cm2的範圍內，高於該強度即使是脫氧血紅蛋白也會造成亞鐵血紅蛋白的氧化，低於該強度範圍則對病毒滅活能力相對較小，難於達到理想的效果。
[0015]二、照射時最好採用石英玻璃作為照射窗口，因為石英玻璃能夠透過紫外線進行照射，而普通玻璃不能透過紫外線。
[0016]本發明具有如下優點:
[0017]①在基本不引起亞鐵血紅蛋白氧化的條件下有效、簡單地實現了對血紅蛋白或血紅蛋白氧載體進行病毒滅活。
`[0018]②不引入外來物質，照射前後溶液組分未發生變化，不需要後續處理。
【具體實施方式】
[0019]以下給出三例病毒滅活驗證實驗，並相應限定了較佳的具體操作環節和參數；但以下示例不應理解為對本發明權利要求的限制。
[0020]實施例一:
[0021]步驟1:在一可密閉容器中加入10mg/mL的豬血紅蛋白90mL，蛋白溶液厚度為6cm,容器上下兩側設兩個面的石英玻璃窗口，再加入IOml豬細小病毒(PPV)，攪拌，在溶液上方通入氮氣，將亞鐵血紅蛋白轉化成脫氧血紅蛋白，待轉化率大於90%時，停止通入氮氣，但是密閉容器，阻止與外界大氣交換；
[0022]步驟2:將兩個紫外燈分別置於石英玻璃窗口前，打開紫外燈調整距離，使照射於液面時的強度為70 μ w/cm2,照射4.5天，照射完畢後收集得到的溶液即為滅活病毒後的溶液。
[0023]分別在滅活前、滅活後第1、2、3、4.5天取樣，用細胞感染法檢測滅活過程中病毒殘餘的滴度，細胞PK-15，檢驗結果病毒滴度降大於41og值，通過盲傳三代實驗，也未發現細胞異常，無病毒毒性。
[0024]實施例二:[0025]步驟1:在一可密閉容器中加入8mg/mL的豬血紅蛋白IOOmL,其中豬偽狂犬病毒(PRV)滴度大於61og值；攪拌，蛋白溶液厚度為5cm，容器上下兩側設兩個面的石英玻璃窗口，在溶液上方通入氬氣，將亞鐵血紅蛋白轉化成脫氧血紅蛋白，待轉化率大於90%時，停止通入氬氣，但是密閉容器，阻止與外界大氣交換；
[0026]步驟2:將兩個紫外燈分別置於石英玻璃窗口前，打開紫外燈調整距離，使照射於液面時的強度為80 μ w/cm2,照射4天，照射完畢後收集得到的溶液即為滅活病毒後的溶液。
[0027]分別在滅活前、滅活後第1、2、3、4天取樣，用細胞感染法檢測滅活過程中病毒殘餘的滴度，細胞PK-15，檢驗結果病毒滴度降大於41og值，通過盲傳三代實驗，也未發現細胞異常，無病毒毒性。
[0028]實施例三
[0029]步驟1:在一可密閉容器中加入4mg/mL的聚合豬血紅蛋白溶液(血紅蛋白氧載體)IOOmL,其中PPV病毒滴度大於61og值，攪拌，蛋白溶液厚度為8cm，容器上下兩側設兩個面的石英玻璃窗口，在溶液上方通入氫氣，將容器連接氣體交換膜，液相一側接通溶液，氣相一側連接氫氣，對血紅蛋白或血紅蛋白氧載體進行脫氧，將亞鐵血紅蛋白轉化成脫氧血紅蛋白，待轉化率大於90%時，撤去氣體交換膜，但是在溶液上方繼續通入氫氣，阻止與外界大氣交換；
[0030]步驟2:將兩個紫外燈分別置於石英玻璃窗口前，打開紫外燈調整距離，使照射於液面時的強度為60 μ w/cm2，照射6天，照射完畢後收集得到的溶液即為滅活病毒後的溶液。
[0031]分別在滅活前、滅活後第1、2、4.5、6天取樣，用細胞感染法檢測滅活過程中病毒殘餘的滴度，細胞為PK-15細胞，檢驗結果病毒滴度降大於41og值，通過盲傳三代實驗，也未發現細胞異常，無病毒毒性。
【權利要求】
1.紫外輻照滅活血紅蛋白及血紅蛋白氧載體中病毒的方法，待處理的血紅蛋白或血紅蛋白氧載體為溶液形態；該方法包括以下步驟: 先用性質較為惰性的氣體將氧合血紅蛋白進行脫氧，使之轉化為脫氧血紅蛋白，防止亞鐵血紅蛋白的氧化，再用紫外燈對脫氧血紅蛋白溶液進行照射，設置照射至液面時的紫外線強度為50 —110 μ w/cm2，並根據照射面積及溶液體積調整照射時間，照射完成後即完成了病毒滅活的過程。
2.根據權利要求1所述的紫外輻照滅活血紅蛋白及血紅蛋白氧載體中病毒的方法，其特徵在於，具體步驟如 下: 步驟(1):取一密閉容器，在該容器中加入血紅蛋白或者血紅蛋白氧載體溶液並進行攪拌，將容器連接氣體交換膜，液相一側接通溶液，氣相一側連接惰性的氣體，對血紅蛋白或血紅蛋白氧載體進行脫氧，在溶液上方同時也通入惰性的氣體，將溶液上方的空氣排出，或者僅在溶液上方連續通入惰性的氣體以降低氧分壓使血紅蛋白脫氧；直至脫氧血紅蛋白大於90%時，撤去氣體交換膜，並在溶液上方繼續通入惰性的氣體,或停止通入惰性的氣體但需封閉容器通氣口以阻止與外界大氣交換；所述惰性的氣體為氮氣、氦氣、氖氣、氬氣、氙氣、氡氣或氫氣； 步驟(2):該容器裝有石英玻璃窗口，將紫外燈置於石英玻璃窗口前，打開紫外燈調整距離，使紫外線透過該石英玻璃窗口照射於液面時的強度為50 —110 μ w/cm2，照射時間根據液體厚度調整，每1.0cm厚度增加大於1.4天照射時間，總厚度不超過20cm ;照射完畢後收集得到的溶液即為滅活病毒後的血紅蛋白或者血紅蛋白氧載體溶液。
【文檔編號】A61L2/20GK103705959SQ201310712556
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月19日 優先權日:2013年12月19日
【發明者】嚴坤平, 陳超, 朱宏莉, 謝於鬥, 楊鵬飛 申請人:陝西佰美基因股份有限公司