解澱粉芽孢桿菌及其用途的製作方法
2023-06-01 14:47:26 2
專利名稱：解澱粉芽孢桿菌及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種有抑菌效果和提高動物免疫能力的解澱粉芽孢桿菌的篩選及應用。
背景技術：
我國作為世界水產大國，也是世界上唯一水產養殖產量高於捕撈產量的國家，2002年水產養殖產量高達2770萬噸，約佔世界水產養殖總產量的70%，這主要得益於我國水產養殖集約化程度的不斷提高。水產養殖已成為我國漁業發展的重點，是我國大農業中發展較快、活力較強、經濟效益較高的產業之一。伴隨著我國水產養殖業的迅猛發展，各類水產病害亦迅猛增長，據不完全統計，目前水產養殖病害在300種以上，每年約有1/10的養殖面積發生病害，年損失產量佔養殖總產量的15 % 30 %，經濟損失高達數百億元，水產動物病害已成為影響我國水產養殖業發展的主要制約因素(黃豔平等，2004)。
針對水產養殖業病害爆發頻率的加劇，抗生素作為重要的抗細菌性疾病的藥物，在水產養殖上得到廣泛應用。如用青黴素和硫酸鏈黴素治療親魚產後受傷引起感染及羅非魚的潰爛病、赤皮病、列印病；用慶大黴素治療草魚「三病」(腸炎病、爛鰓病、赤皮病)；用紅黴素治療球菌引起的感染和虹鱒魚的細菌性腎臟疾病等都收到良好的效果；加氯黴素可以抑制淡水養殖中的致病性氣單胞菌，氟喹諾酮類抗菌素可以抑制海水養殖中致病性弧菌。這在一定程度上極大地促進了水產養殖業的發展。但同時，養殖水體中長期使用抗生素已引發一系列環境和社會問題，尤其是過量的使用抗生素使水體微生物選擇壓力增大，一方面導致抗藥微生物滋生，可改變水體微生物群落結構，惡化水體的適養性，另一方面引起水產動物體內菌群失調，易引發內源性、外源性和二重感染(胡彩紅，2005)。因此，限制和減少抗生素類藥物在水產養殖水體中的使用，尋找抗生素的替代品已經成為水產養殖業發展的必然趨勢。益生菌不僅可避免抗生素的副作用、達到防治疾病的效果，而且能促進動物生長。近年來，益生菌作用抗生素類藥物的替代物，在養殖業得到廣泛的關注。現代微生態學研究表明，微生物在水產養殖中佔有重要的地位，直接影響產量、物質循環、動物營養、水質、疾病控制及養殖水環境(Moriarty, 1998)。隨著微生物學和微生態學的深入研究,利用益生菌來調節動物體內生態環境、改善養殖生態環境、增強機體免疫功能、抑制病原微生物、減少疾病發生，正逐漸成為各國研究熱點。由於益生菌製品沒有殘留，也不會產生抗藥性，在中國、印度等水產養殖大國得到廣泛的應用，並主張用其替代抗生素。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種解澱粉芽孢桿菌，該解澱粉芽孢桿菌有抑菌效果和提高動物免疫能力。為了解決上述技術問題，本發明提供一種解澱粉芽孢桿菌，保藏名稱解澱粉芽孢桿菌SC06 (Bacillus amyloliquefaciens SC06),保藏單位中國典型培養物保藏中心,保藏地址中國武漢武漢大學；保藏日期2012年7月11日，保藏號CCTCC No: M2012280。本發明還同時提供了上述解澱粉芽孢桿菌的用途，用於抑菌或者用於提高動物的免疫能力。作為本發明的解澱粉芽孢桿菌的用途的改進動物為水生動物或畜禽。本發明以SC06菌株總DNA為模板，使用通用引物上遊引物(Pl):5』 一 AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT —3，下遊引物(P6):5』 一 TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC — 3』 ；進行PCR擴增獲得的16s rDNA部分序列；通過Blast與GenBank收錄的細菌16srDNA基因序列比對，發現SC06菌株與解澱粉芽孢桿菌的同源性為99%。本發明的解澱粉芽孢桿菌可作為益生菌用於提高水生動物、畜禽生長，並提高其抗氧化和免疫功能。本發明的解澱粉芽孢桿菌實際使用時，可採取向水中投放解澱粉芽孢桿菌SC06的方法，一般控制解澱粉芽孢桿菌SC06在水體中的濃度為O. 5飛X 107CFU/mL ;也可在每克常規水生動物/畜禽基礎日糧中添加解澱粉芽孢桿菌SC06 O. 5飛X 105CFU。本發明的解澱粉芽孢桿菌也可先製成幹菌粉，再進行如上操作。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是SC06的掃描電鏡圖片；圖2是SC06對甲魚生長的影響對比圖。
具體實施例方式實施例1、解澱粉芽孢桿菌SC06的獲得I)、製備稀釋液稱取土壤(採自杭州郊區蔬菜地)2g，放入IOOml無菌水中，用高速組織搗碎機搗碎。無菌操作吸取搗碎液1. Oml加入9. Oml無菌水中，再用無菌水稀釋為10_\10_2，10 _3、ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ '10_7共七個濃度梯度。2)、培養取各濃度的稀釋液IOOul分別塗布於LB培養基平板(蛋白腖10g/L，NaCl 10g/L,酵母浸出物5g/L，瓊脂16g/L，其餘為水；用IOmoI/L NaOH調節pH7. 0，121°C滅菌20分鐘)，晾乾後倒置恆溫箱內30°C培養。3)、菌株的分離、純化在LB培養基上於30°C培養48 h，即有菌落出現。用接種針挑取單個菌落，在LB培養基平板表面連續劃線培養，選擇那些形態不一樣的菌落，重複幾次後便可形成單獨孤立的菌落，因而獲得純培養菌株。4)、不同時間抑菌效果測定將每個單菌落活化後分別置於50ml胰蛋白腖大豆肉湯培養基(Tryptone soyaBroth, TSB，購自杭州微生物試劑廠公司)中培養，初始接種濃度為1. OX IO6 CFU/mL, 24h後調整各菌液至1. OX IO9 CFU/mL備用。LB培養基平板高溫滅菌(121°C滅菌20分鐘)後，冷卻至50-60°C後，按照1% (體積比)的接種量加入一種病原性細菌菌液(培養16h的嗜水氣單胞菌(Aeromonas HydroPhila ATCC 14715)、副溶血弧菌(Vibrio ParahaemolyticusATCC 27519)和突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens ATCC 13525)),倒平板,放置無菌室約lh，倒置放於4°C冰箱中lh，用直徑O. 25cm打孔器在平板表面均勻的打孔，然後按照每孔10 μ I的加樣量加入被篩選菌株菌液，在30°C培養，每隔3h取樣，測定24h內的抑菌圈直徑變化，每個平皿設3個重複。挑選出對所試3株病原性細菌的總抑制效果最佳的菌落，命名為SC06。SC06對嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌抑制效果最為明顯，12h抑菌環平均直徑分別為16. 2和13. 1mm，對螢光假單胞菌12h抑菌環平均直徑為9. 4mm。5)、SC06拮抗性測定將菌株SC06在LB液體培養基(蛋白腖10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，其餘為水；用10mol/L NaOH調節pH7.0，121°C滅菌20分鐘)30°C進行培養，每隔3h取樣，測定其0D600。結果顯示，SC06生長較快，18h的OD600為1. 72±0· 16。6)、共凝集試驗參照Chabrillon M.，et al 2005方法並稍作修改進行。於LB液體培養基中接種病原性細菌和被篩選細菌，30°C過夜培養，測定其0D600，並將其OD稀釋至O. 5，然後取菌株SC06和病原性細菌各1. 5ml於無菌具塞試管中，渦旋振蕩混勻，30°C靜置培養4h後測定0D_。3.0ml的病原性細 菌或被篩選細菌30°C靜置培養4h作為對照管。其共凝集率表示共凝集率=[(SC+LC)/2-(S+L)/( SC+LC)/2] XlOO (SC和LC :對照管病原細菌和益生菌的終0D600 ；L+S :試驗管終0D600)。結果發現，SC06對3株病原性細菌均具有較好共凝集效果，對 A. hydroPhila、P. flurorescens、V. Parahaemolyticus 的共凝集率分別為30. 42%,41. 20%,39. 20%。備註說明病原性細菌是指嗜水氣單胞菌(Aeromonas HydroPhila ATCC 14715)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus ATCC 27519)和突光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens ATCC 13525)。7)、菌種鑑定(I)形態特徵在液體培養基中呈均勻混濁並伴有微量沉澱，輕輕搖動沉澱即散開。在營養瓊脂平板上菌落SC06直徑為2. O 3. Omm，平臺狀，邊緣整齊，不透明，有光澤，無色素，質地較軟。SC06在掃描電鏡的形態如圖1。SC06首尾相連，形成鏈狀。(2) 16S rRNA 序列分析對分離篩選到的菌株SC06進行進一步的16S rRNA序列分析與比對。根據細菌16S rDNA的保守序列設計一對引物，上遊引物(Pl):5』 一 AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT —3，下遊引物(P6) : 5 』 一 TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC — 3 』由上海生工合成。PCR擴增分別以篩選得到的菌株為模板。反應條件95°C預變性 5min，94°C變性 50s，52°C退火 lmin，72°C延伸 Imin 30s，反應 30 個循環。目的片斷按照常規方法(Samtoook，et al.，2001)進行克隆和序列測定，測定結果與GenBank中所登錄的16S rRNA序列(登錄號NC_017912.1、NC_017061.1和NC_016784.1等)進行比對分析,基因同源性達到99%以上。根據《Bergey’s Mannual ofDeterminative Bacteriology)) (Holt, J. G. , Gibbons, N. E. , 1994)和《常見細菌系統鑑定手冊》(東秀珠和蔡妙英等，2001 )，通過性態特徵和16S rRNA序列分析，確定菌株SC06為解澱粉芽孢桿菌。將該菌株進行保藏，保藏名稱為解澱粉芽孢桿菌SC06 (Bacillusamyloliquefaciens SC06)，保藏單位中國典型培養物保藏中心，保藏地址中國武漢武漢大學；保藏日期=2012年7月11日，保藏號CCTCC No: M 2012280。實施例2、解澱粉芽孢桿菌菌劑的製備方法解澱粉芽孢桿菌SC06接種於LB液體培養基中，30°C培養20小時後，離心取菌泥，60度恆溫乾燥至恆重、與玉米澱粉按4:1的重量比(B卩，玉米澱粉恆溫乾燥後的菌泥=4:1的重量比)混合而製成幹菌粉，每克幹菌粉中SC06活菌數為108cfu。實施例3、SC06可提高羅非魚的抗氧化能力尼羅羅非魚(吉福品系)由浙江躍騰水產食品有限公司提供，用2. 5%(質量濃度)的食鹽水進行浸泡消毒，在浙江大學飼料科學研究所水產動物營養實驗室暫養14d後，選取體重約2. 50g的健康的尼羅羅非魚，採取單因子設計方案對照組和SC06組。每組3個平行重複，每個重複30尾魚。實驗魚在密閉式過濾循環系統的水族箱(IOOcmX 50cmX 50cm)中飼養，實際水體積為200L，飼養水溫25-28°C，AC0-318型空氣壓縮機24h增氧。每天9 00和19 00兩次投餌(對照組為常規的尼羅羅非魚飼料；SC06組為在常規的尼羅羅非魚飼料的基礎上每4天向水體中添加一次幹菌粉，直至SC06在水體中的濃度為107CFU/mL)，日投餌率為體重的3.5%。每兩周稱重一 次，調節投餌量。每天觀察魚的健康狀況，記錄投餌量、死亡數量。本實驗期間不換水，水源為充分曝氣除氯的自來水。試驗21d後進行相應的檢測，具體如表I所述。結果表明，與對照組相比，SC06組(即SC06菌株添加組)的血清中CAT (過氧化氫酶)活性、T-AOC (總抗氧化能力)和MDA (脂質過氧化物)含量分別降低81. 64% (P<0. 05),61.99% (P〈0. 05)和 82. 14% (P〈0. 05)，超氧根陰離子自由基(02 —)活力升高31. 58% (P<0. 05), GSH-Px (穀胱甘肽過氧化物酶)基本不變。因此，SC06可有效提高羅非魚機體中CAT和GSH-Px活性，對降低血清中脂質過氧化對機體造成的危害有重要的作用。表1、SC06對羅非魚血清抗氧化指標的影響
權利要求
1.解澱粉芽孢桿菌，其特徵是保藏名稱解澱粉芽孢桿菌SC06 (Bacillus amyloliquefaciens SC06),保藏單位 中國典型培養物保藏中心，保藏地址中國武漢武漢大學；保藏日期2012年7月11日， 保藏號CCTCC No: M 2012280。
2.如權利要求1所述的解澱粉芽孢桿菌的用途，其特徵是用於抑菌或者用於提高動物的免疫能力。
3.根據權利要求2所述的解澱粉芽孢桿菌的用途，其特徵是所述動物為水生動物或畜禽。
全文摘要
本發明涉及一種有抑菌效果和提高動物免疫能力的解澱粉芽孢桿菌的篩選及應用。本發明公開了一種解澱粉芽孢桿菌，其保藏名稱解澱粉芽孢桿菌 SC06 (Bacillus amyloliquefaciens SC06)，保藏單位中國典型培養物保藏中心，保藏地址中國 武漢 武漢大學；保藏日期2012年7月11日，保藏號CCTCC No: M2012280。解澱粉芽孢桿菌 SC06接種於LB液體培養基中培養後，離心取菌泥，乾燥至恆重，與玉米澱粉等混合後製成幹菌粉；在動物的常規飼料中添加上述幹菌粉，餵食動物；從而實現用於抑菌或者用於提高動物的免疫能力，動物是指水生動物或畜禽。
文檔編號C12N1/20GK103045498SQ20121038296
公開日2013年4月17日 申請日期2012年10月10日 優先權日2012年10月10日
發明者李衛芬, 鄧斌, 張小平, 黃琴, 姚江濤, 餘東遊 申請人:浙江大學