人蛋白賴氨酸甲基轉移酶set9融合蛋白的製備方法
2023-06-01 19:17:11 1
專利名稱：人蛋白賴氨酸甲基轉移酶set9融合蛋白的製備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體應用DNA重組技術構建了人蛋白賴氨酸甲基化轉移酶(protein lysine meth yltransferases, PLMTs 或 PKMTs) SET9 融合蛋白的高效原核表達系統，建立了通過基因工程大腸桿菌發酵製備重組人SET9融合蛋白的方法。
背景技術：
SET9又稱組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶、組蛋白H3-K4甲基轉移酶，是一種蛋白修飾酶，能將S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)所供甲基轉移至革巴蛋白賴氨酸殘基上使其甲基化，引起蛋白質結構和功能改變並產生相關生物效應。SET9全長為366個胺基酸，C端含保守的SET結構域，分子量大約為50KD，其表達基因位於第四號染色體4q28。SET9能使組蛋白H3第4位賴氨酸(lysine 4 of histone 3，H3K4)單甲基化，在調控染色質結構和基因表達中起著至關重要的作用。此外，更重要的是SET9能使p53與TAF10等一些轉錄因子、腫瘤抑制因子、膜相關受體等非組蛋白單甲基化，調節蛋白穩定性與轉錄活性(表I)。SET9對非組蛋白賴氨酸的甲基化作用會產生複雜的生物學效應，如甲基化P53的K372位點可增加p53穩定性及其對靶基因的活化作用；甲基化衍生因子(eIongation factor，E2FI)的K185位點可抑制該蛋白的乙醯化和磷酸化，並激活蛋白泛素化，抑制凋亡；還可使成視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, pRb)、雌激素受體a (estrogen receptor a，ER a )等蛋白甲基化，影響它們的生物學效應。研究表明乳腺癌細胞中SET9下調會導致雌激素(ER)在其靶基因部位的募集反應受損，從而減弱ER驅動的轉錄反應。可見SET9介導的非組蛋白賴氨酸甲基化作用異常與腫瘤或其他疾病發生機制有關。因此，SET9是一種非常有前景的生物化學蛋白修飾酶，與染色體結構維持、細胞周期及凋亡調控等有關。SET9及其底物可作為腫瘤等疾病診療中的標誌物或靶點，促進有關試劑或新藥的研發。目前提純SET9蛋白主要通過組氨酸(His)標籤或GST標籤進行融合蛋白表達與純化。組氨酸(His)標籤的融合蛋白表達存在不可溶性問題，純化時需要變性，因此，只有經過復性過程才能獲得活性蛋白，從而增加了提取活性SET9蛋白的困難。一般經GST標籤提純的蛋白都用於抗體製備、蛋白檢測、ELISA等試驗。隨著科學研究的深入，對具有蛋白賴氨酸甲基轉移酶活性的SET9蛋白的需求會越發迫切。表I現有報導關於SET9單甲基化的非組蛋白底物與涉及的生物學功能
權利要求
1.人蛋白賴氨酸甲基轉移酶SET9融合蛋白的製備方法，其特徵在於將SET9基因片段連接至含可編碼穀胱甘肽S-轉移酶讀碼框架的載體質粒，再轉化宿主菌，宿主菌經誘導表達後通過Glutahione Agarose吸附柱純化。
2.人蛋白賴氨酸甲基轉移酶SET9融合蛋白的製備方法，其特徵在於步驟為 a.以pCMV-SET9為模板，PCR擴增含SET結構域的SET9基因片段上遊引物SET9_f 序列為5』 -ACCGAATTCCATGGATAGCGACGAC-3』，下遊引物 SET9_r 序列為5』 -CTCCTCGAGTCATTACTTTTGCTGGGTGGCCTG-3』，反應體系為5u L 10 X PCRBuffer, 0. 25 u L 2. 5u/u LPfu,2u LIOmM dNTP, 0. 5 u L IOuM SET9-f, 0. 5 u LlO u MSET9-r, I u L pCMV-SET9, dH20 補足體系至.50 u L ;反應條件為94°C變性13分鐘，進入循環94°C變性I分鐘，60°C退火I分鐘，72°C延伸2分鐘，共35次循環，末次循環後72°C延伸10分鐘，得SET9-PCR產物如SEQ ID No. I所示； b.將SET9-PCR產物連接至pGEX-6P-3上將原核表達載體pGEX_6P_3轉入大腸杆 菌MC1061菌株，挑取單個菌落培養，用質粒提取試劑盒大量提取質粒DNA，溶解於50 ii L的去離子水中，-20°C貯存；用EcoR I和Xho I將SET9-PCR產物及pGEX_6P_3表達載體分別做雙酶切，然後進行連接得PGEX-SET9重組質粒；其中，酶切反應體系4iiL IOxBuffer Y+/TANG0 , 2u L 20U/ u LXhoI，2u L IOU/ u LEcoRI，30 u LSET9-PCR 產物或 12u LPGEX-6P-3，dH20補足體系至40 ii L ;酶切反應條件37 °C，3小時；PCR產物純化試劑盒回收；用鹼性磷酸酶處理上述酶切產物5uL 10XCIPBuffer，37ii LSET9-PCR酶切產物或 37iiL pGEX-6P-3 酶切產物，I ii L AlkalinePhosphatase, dH20 補足體系至 100 y L ;孵育反應條件37°C，2小時；再75°C，10分鐘；連接反應體系2iiL 10XT4DNA LigaseBuffer, I u L900ng/ u L鹼性磷酸酶處理的pGEX_6P_3，I u L300ng/ u L鹼性磷酸酶處理的SET9-PCR, 14 u LdH2O, 2u L 400u/ u LT4DNA Ligase,前四項加入 eppendof 管後 65°C 孵育 3分鐘，然後立即置於冰上，加入連接酶，連接反應條件4°C，過夜；連接產物pGEX-SET9重組質粒轉化至MC1061中，挑取克隆，提質粒進行酶切鑑定，再將pGEX-SET9、pGEX-6P-3進行質粒大提； c.用pGEX-SET9重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)表達菌株，塗布含100mg/L氨苄青黴素的LB瓊脂平板，37°C恆溫培養過夜；挑取單一GST-SET9融合蛋白表達陽性菌落接種在IOmL含氨苄青黴素100mg/L抗性的LB液體培養基中，37°C振蕩培養過夜，次日按I :60的體積比例轉接於400mL含氨苄青黴素100mg/L抗性的培養基中，於37°C劇烈振蕩培養至.0D600nm約為0. 5 0. 8，加入IPTG至終濃度為ImM以誘導GST-SET9表達，繼續培養5. Oh,離心收取細胞，置_70°C冷凍過夜，次日用5mLPBST重新懸浮細胞，於4°C溫度下超聲破碎細菌，再利用Glutathione Agarose吸附柱提純得人蛋白賴氨酸甲基轉移 酶SET9融合蛋白。
全文摘要
人蛋白賴氨酸甲基轉移酶SET9融合蛋白的製備方法，將SET9基因片段連接至含可編碼穀胱甘肽S-轉移酶讀碼框架的載體質粒，再轉化宿主菌，宿主菌經誘導表達後通過GlutathioneAgarose吸附柱純化。利用大腸桿菌BL21(DE3)表達菌的T7RNA聚合酶基因可受IPTG誘導表達、該菌沒有膜結合性蛋白分解酶活性則可抑制表達的融合蛋白質分解等優點，本發明將重組載體pGEX-SET9轉入BL21(DE3)表達菌，成功地構建了GST-SET9融合蛋白的原核表達系統，並提純了高活性的融合蛋白。可用於非組蛋白甲基化效應、SET9抗體開發等實驗室研究。
文檔編號C12N15/70GK102719456SQ20121019250
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月12日 優先權日2012年6月12日
發明者餘衛平 申請人:東南大學