豬鏈球菌菌株及其用途的製作方法
2023-06-03 14:43:11 1
專利名稱：豬鏈球菌菌株及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種鏈球菌，尤其涉及豬鏈球菌菌株及其用途。
背景技術：
豬鏈球菌(Streptococcus suis)是條件性致病菌，廣泛分布於自然界中，在動物的呼吸道、腸道、生殖道等處常在，可引起豬腦膜炎、關節炎、心內膜炎、敗血症、肺炎和突然死亡，嚴重危害養豬業的發展。鏈球菌之所以能致病，是因為其可產生多種酶和毒素，如透明質酸酶、鏈激酶、鏈道酶、DNA酶和溶血菌素O、溶血菌素S及紅斑毒素；根據莢膜多糖抗原的差異，可將其分為35個血清型，即1～34以及1/2型。對豬致病性較強的為豬鏈球菌1型、2型和9型。以溶血性鏈球菌引起的敗血性鏈菌病危害最大，腦炎型次之，關節炎型和淋巴結膿腫型危害小，但無乳鏈球菌是繁殖母豬的大敵。
豬鏈球菌為革蘭氏陽性菌，可在外界環境中存活很長時間，特別是在糞便中及被汙染的環境和帶菌豬是重要的傳染源，超急性死亡沒有任何症。不分品種、年齡、性別的豬只一年四季都可感染本病，哺乳和斷奶後仔豬發病死亡率高達80％以上，目前把鏈球菌分為下列五種類型。1、急性敗血型(C群鏈球菌引起)常發生在肥育豬，表現為體溫升高到41-42℃，最高可達到43℃，常有漿液鼻漏、眼結膜潮紅、呼吸漸快、呈肺炎狀、便秘幹硬、腹下有紫紅斑，皮膚有毛血點，頸背皮膚呈「刮痧狀」出血點或斑，如患豬耐不過，常出現突然死亡(一般耐過12-18小時轉為亞急性)。2、腦膜炎型(C群鏈球菌引起)多發生在哺乳和斷奶仔豬(8周齡仔豬)病初體溫可升高到40.5-42.5℃。中豬和母豬，便秘、很快出現神經症狀(注意在出現神經症狀之前有一個高熱時間，一般很短(4-8小時)不易發現，給以後的確診帶來誤區)，出現歪頭、跛行、轉圈、磨牙、發抖、眼球鼓脹、口角流白沫、不能站立、爬行或後肢麻痺，共濟失調，病程1-3天，如不及時控制很快死亡。(注早期發現可見豬耳朵朝後抿，初步定為本病)。3、關節炎型多發生於新生仔豬，出現關節腫脹和蹄甲炎，跛行。4、膿腫型多為E群鏈球菌感染引起咽部、頸部、腿部淋巴節化膿，C群可引起皮膚形成膿腫，有熱疼感影響採食、呼吸和吞咽。5、無乳型生產母豬臨產前發熱或不食，產後1-3天出現發熱症狀40℃左右，造成無乳、回乳和乳房膿腫等。所有鏈球菌感染無論慢性或急性，多表現為食欲不振，有輕微跛行現象。目前，我們在發病豬肺臟中分離到一株B群鏈球菌，與上述的C群鏈球菌、E群鏈球菌不同。
發明內容
本發明的目的是提供一種新的豬鏈球菌菌株，該菌株可作為標準的試驗用菌株。
本發明的目的是通過以下技術途徑來實現的一種豬鏈球菌菌株(Streptococcus suis)，該微生物的保藏號是CGMCCNo.1316；保藏地址是北京市海澱區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏日期是2005年2月21日。
本發明菌株的分離方法如下將病死豬只，剖開胸腔取出肺臟，肺臟表面消毒後，取無菌剪刀，剪開一個深部切口，將無菌鉑金耳深入肺臟切口內部，蘸取內部組織液，劃斜線接種在含5％綿羊血PPLO固體培養基上(取滅菌PPLO瓊脂培養基100毫升，加熱融化，待冷卻至50℃時，以無菌手續加入脫纖血5毫升，輕輕搖勻，防止產生氣泡，傾注於滅菌的平皿中，經無菌檢查後，放在冰箱中保存備用；PPLO固體培養基購於Difco公司)。將平板倒置於37℃恆溫培養箱中14-18小時後，將平板取出挑取灰白色、半透明、表面光滑、圓形、隆起的周圍有α溶血環小菌落進行革蘭氏染色，鏡下觀察為革蘭氏陽性鏈狀小球菌，即為豬鏈球菌。
蘭氏分群通過法國梅裡埃公司提供的蘭氏分群試劑盒分群為B群。
形態及染色細菌菌體為卵圓形，在固體培養基上為短鏈存在，在液體培養基上呈較長的鏈狀生長，革蘭氏染色陽性，無抗酸性。
培養及生化特性兼性厭氧菌，在5％二氧化碳中生長快於有氧條件，培養最適溫度37℃。在固體培養基上培養時，在培養基上加入綿羊血、犢牛血清有助於本菌生長。菌落為灰白色、半透明、表面光滑、圓形、隆起的小菌落，菌落周圍有α溶血環。
本發明菌株可作為科研工作者標準的試驗用菌株。通過該菌株可以了解該菌的DNA分型、該菌對藥物的耐藥機制、該菌多重耐藥機制及該菌在豬體內的病理複製模型。
本發明菌株生化反應試驗一、試驗材料1、供試菌株本發明菌株。
2、培養基的配製5％牛血清PPLO液體培養基取21克PPLO肉湯(Difco)加入1000毫升蒸餾水中，121℃15分鐘高壓滅菌後冷藏備用。在使用時，加入5％牛血清。購於PPLO肉湯Difco公司。
二、試驗方法及結果挑取單個本發明菌落，接種於5％牛血清PPLO液體培養基中，37℃培養14-18小時，將純培養的細菌接種於各種生化反應管中，在37℃恆溫培養箱中孵育過夜後，取出觀察結果。通過生化反應管中指示劑的顏色變化，判定細菌生化反應結果。具體結果如下葡萄糖(+)、麥芽糖(+)、蔗糖(+)、乳糖(+)、松三糖(-)、核糖(+)、山梨醇(-)、甘露醇(-)、阿拉伯糖(-)、棉子糖(+)、膽汁溶解(-)。
本發明菌株藥敏試驗將過夜培養本發明菌液，用滅菌生理鹽水稀釋至0.5麥氏單位，用無菌棉拭子沾取在PPLO固體培養基(PPLO固體培養基購於Difco)上密集劃線接種，三次劃線，每次劃線旋轉60度，保證接種物均勻分布。塗布菌液的平板於室溫中乾燥3-5分鐘，用無菌鑷子取藥敏紙片(購於上海伊華醫學科技有限公司)，貼於平板表面，並用鑷子輕壓一下紙片使其貼平。每張紙片的間距不小於24mm，紙片的中心距平板的邊緣不小於15mm。將貼好紙片的平板置37℃孵育18-24小時後，用標尺量取抑菌圈直徑。根據抑菌圈的大小(不同抗生素其抑菌圈大小的標準不一致)，判定為敏感，耐藥或中度耐藥。
試驗結果如下(抑菌環直徑)紅黴素19.4mm、青黴素17.0mm、氟哌酸11.2mm、氯黴素18.6mm、氨苄西林17.0mm、四環素0.0mm、複方磺胺0.0mm、先鋒V號15.2mm、頭孢呋新16.0mm。
根據NCCLS判斷標準，本發明菌株對紅黴素、頭孢呋新、先鋒V號中度耐藥、對氯黴素敏感、對青黴素、氟哌酸、氨苄西林、四環素、複方磺胺耐藥。
試驗結果表明，本發明菌株可作為標準的藥敏試驗用菌株。
本發明菌株對紅黴素耐藥表型的確定耐藥表型的測定以改良的雙紙片法測定，在塗布本發明菌株菌液的平板上，間隔2Cm貼上紅黴素及克林黴素紙片，過夜培養後觀察結果。如果對克林黴素敏感，繼續做15、16元環大環內酯類藥物的敏感性試驗。
試驗結果如下(抑菌環直徑)紅黴素19.4mm(中度耐藥)、克林黴素0mm(耐藥)，因豬鏈球菌同時對紅黴素、林可黴素耐藥，所以本發明菌株對紅黴素耐藥表型為內在性耐藥表型。
本發明菌株對紅黴素耐藥基因的確定對紅黴素耐藥的本發明菌株染色體DNA的提取純的細菌菌落或細菌懸液沉澱物溶解在20μl水中，95℃加熱5分鐘，12,000rpm離心2分鐘，上清液儲存在-20℃以備用。
ermb/mefA耐藥基因的擴增對紅黴素耐藥的菌株進行ermb和mefA的PCR。引物均由上海博亞公司合成。ermb所用引物為5′-GAAAAGGTACTCAACCAAATA-3′(上遊)和5′-AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC-3′(下遊)，擴增片斷639bp。反應條件93℃初始變性5min後，94℃1min，54℃2min，72℃2min，30個循環後72℃延伸10min。mefA耐藥基因所用引物5′-AGTATCATTAATCACTAGTGC-3′(上遊)和5′-TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG-3′(下遊)，擴增片斷400bp。94℃初始變性4min後，94℃1min，54℃2min，72℃2min，30個循環後72℃延伸10min。
試驗結果如下PCR結束後，擴增到639bp的目的產物，將得到的目的產物在blast上檢索，與NCBI GenBank上Streptococcus gallolyticus(AY183117.1)ermb基因同源性達99％；PCR結束後，沒有擴增到的mefA耐藥基因。
試驗結果表明，本發明菌株可用於耐藥基因的確定。
權利要求
1.一種豬鏈球菌菌株(Streptococcus suis)，其微生物保藏號是CGMCCNo.1316，保藏日期是2005年2月21日。
2.按照權利要求1所述的豬鏈球菌菌株，其微生物特徵是細菌菌體為卵圓形，在固體培養基上為短鏈存在，在液體培養基上呈較長的鏈狀生長，革蘭氏染色陽性，無抗酸性，兼性厭氧菌，在5％二氧化碳中生長快於有氧條件，培養最適溫度37℃，菌落為灰白色、半透明、表面光滑、圓形、隆起的小菌落，菌落周圍有α溶血環。
3.權利要求1或2所述的豬鏈球菌菌株在作為試驗用標準菌株中的用途。
4.按照權利要求3所述的用途，其特徵是豬鏈球菌菌株在藥敏試驗中的用途。
5.按照權利要求3所述的用途，其特徵是豬鏈球菌菌株在確定耐藥基因中的用途。
全文摘要
本發明公開了豬鏈球菌(Streptococcus suis)的一種新菌株，微生物保藏號是CGMCC No.1316，保藏日期是2005年2月21日；本發明菌株可作為科研工作者標準的試驗用菌株；通過該菌株可以了解該菌的DNA分型、該菌對藥物的耐藥機制、該菌多重耐藥機制及該菌在豬體內的病理複製模型。
文檔編號C12R1/46GK1824769SQ20051000876
公開日2006年8月30日 申請日期2005年2月25日 優先權日2005年2月25日
發明者李豔華, 蔡雪輝, 姜成剛, 劉永剛, 王洪峰, 柴文君 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所