樹鼩角膜內皮細胞的體外分離及純化方法與流程
2023-06-03 22:42:01 1
本發明涉及一種樹鼩角膜內皮細胞的體外分離及純化方法。
背景技術：
角膜內皮細胞（Corneal Endothelial Cells，CECs）是一種來源角膜最靠近內側的一層內皮細胞，它的液體屏障和Na+-K +離子泵功能對於維持角膜透明至關重要，各種損傷因素引起角膜內皮細胞功能失代償將導致角膜水腫混濁。穿透角膜移植術是取代病變或受損的內皮細胞恢復角膜透明的有效方法，但供體來源短缺及術後免疫排斥反應的發生限制了手術的開展。近年來隨著細胞體外培養技術的發展，體外培養角膜內皮細胞進行內皮移植成為新的發展趨勢，其中高質量的種子細胞是構建內皮細胞移植能否成功的重要影響因素。但由於人類角膜供體的極其短缺，限制了實驗研究的進展，尋找一種適用的、可以代替人類角膜內皮細胞的實驗用細胞迫在眉睫。
目前已從人、兔、羊和大小鼠中分離培養出CECs，但各物種的CECs在形態和反應性上存在種屬差異，如體外貼壁生長時，不同種屬的CECs細胞形態明顯不同。最近研究發現，樹鼩（Tupaia belangeri）與恆河猴的角膜內皮細胞由於其具有細胞面積較均衡、變異係數小和六邊形細胞比例高等特點而被認為可以作為研究人類角膜內皮疾病的合適動物，加之與非人靈長類動物相比，樹鼩來源廣泛、價格低廉，被預測在角膜內皮疾病相關研究中具有良好的應用前景。只有建立一套有效的針對樹鼩角膜內皮細胞的體外分離、培養及鑑定的方法，才能提供一種適用的、可以代替人類角膜內皮細胞的實驗用細胞。
角膜內皮細胞體外培養常用的取材方法是組織膜塊貼壁法、酶消化法和揭膜-消化兩步法，現有的CECs方法，均不能很好的、快速有效的將樹鼩CECs從動物體內分離。目前研究者使用的一般組織膜塊貼壁法並不能使角膜內皮有效貼壁；而一般的酶消化法和貼壁-消化兩步法，可以將樹鼩CECs從動物體分離，但其分離得到的細胞純度不理想，具有更強增殖性的雜質成纖維細胞往往會成為優勢群體而抑制CECs的生長而影響CECs的體外培養實驗。基於此，現在亟需開發一套針對樹鼩CECs原代細胞的體外分離及純化方法。
技術實現要素：
為解決現有的樹鼩角膜內皮細胞難以成功分離，分離得到的CECs純度不理想的問題，本發明一種樹鼩角膜內皮細胞的體外分離及純化方法，該方法能將樹鼩CECs原代細胞很好的分離，大大提高純化效率。
本發明通過下列技術方案實現：一種樹鼩角膜內皮細胞的體外分離及純化方法，包括下列步驟：
（1）樹鼩角膜內皮原代細胞的分離：
將成年樹鼩死體的後彈力層完整撕下，加入3mL消化液，置於37℃的搖床上消化2h後以1500rpm離心10min，用培養液衝洗3次後重懸細胞，再以1500r/min離心10min，棄上清，加入5mL培養液吹打混勻後移至25cm2培養瓶中，將沉澱吹打混勻，在37℃、5%CO2的條件下培養25～30d至P5代，隔日換培養液，得到培養樣品；
（2）樹鼩角膜內皮細胞的純化：
聯合使用差速消化法輔助細胞純化：將步驟（1）所得培養樣品，使用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液消化1～2min，顯微鏡下觀察到大部分成纖維細胞變圓、懸浮後用含10%FBS的DMEM/F12細胞培養液終止消化，反覆吹打後棄掉消化下來的細胞，再用PBS衝洗3次後添加培養液繼續培養，24h後全量換液，以後隔天換液；
（3）CECs的傳代培養：
待步驟（2）培養的細胞生長至80%融合度後，用0.25%胰酶消化按1:2傳代培養，傳至P5代的角膜內皮細胞。
所述步驟（1）的消化液是含膠原酶75μg/mL、中性蛋白酶20μg/mL、DTT 0.5mg/mL和FBS 1%的DMEM低糖培養基。
所述步驟（1）、（2）的培養液是經下列操作製得：將Ham’s F12培養液與M199培養液按1:1質量比混合，再加入5%FBS、20μg/mL抗壞血酸鈉、5μg/L胰島素、1%ITS（Insulin transferrin selenium）、100U/mL青黴素和100μg/mL鏈黴素，5ng/mL EGF(epidermal growth factor)，添加10μmol/L的TGF-β抑制劑（SB431542，Selleck），即得到培養液。使用TGF-β抑制劑抑制雜質成纖維細胞的生長。該培養液分可在2～8℃保存1周。
樹鼩角膜內皮細胞的鑑定：
用蘇木精-伊紅染色進行形態學鑑定：將步驟（3）傳至P5代的角膜內皮細胞接種至6孔板上，待角膜內皮細胞生長至80%融合度後，棄去培養液，使用4%甲醛溶液固定10min，再以PBS衝洗3次，蘇木精染色20s，PBS衝洗3～5次，伊紅負染10min；在相差顯微鏡下觀察細胞形態；
使用神經元特異性烯醇酶（NSE）免疫螢光染色進行鑑定：將培養至P5代的CECs融合至80%面積的細胞培養瓶，使用4%的甲醛溶液固定20min，PBS清洗3次，每次衝洗2min，再以0.5%的Triton-X100穿孔15min，PBS漂洗三次，然後用山羊血清封閉液封閉30min，PBS漂洗三次，再加入1%BSA稀釋的兔抗人神經元特異性烯醇酶（NSE）一抗（1:1000），4℃過夜，PBS漂洗三次，加入1%BSA稀釋的螢光標記的羊抗兔IgG（1:200），37℃孵育1h，PBS漂洗三次，抗淬滅封片劑封片，在螢光顯微鏡下觀察。
本發明通過大量試驗篩選，最終提出最適消化液濃度組合，同時提出了在培養基中添加TGF-β抑制劑，聯合差速消化分離法和低濃度血清培養。採用上述技術方案的進行樹鼩角膜內皮原代細胞體外分離、純化，可以成功分離得到樹鼩角膜內皮細胞，分離得到的角膜內皮細胞具有較高的細胞活力，在傳至P3代可以實現樹鼩角膜內皮細胞的純化，純化的細胞具有典型的內皮細胞形態，經NSE免疫螢光鑑定，染色率高。該方法純化效率大大提高，價格低廉、使用方便，可以獲得大量樹鼩角膜內皮細胞。
與現有技術相比，本發明的有益效果是在於，本發明首次提供了樹鼩角膜內皮細胞原代分離及純化方法，可以實現樹鼩角膜內皮細胞的體外培養，填補了目前沒有針對樹鼩這一物種特定的角膜內皮原代細胞體外培養技術的空白，分離得到的角膜內皮細胞具有較強的細胞活力與較高的CECs細胞純度，本方法同時在體外培養過程中提高了角膜內皮細胞的純度，極大程度地避免了雜質成纖維細胞對角膜內皮細胞生長與增殖的幹擾。此外，本發明提供的原代細胞的取材及純化方法操作簡單，價格低廉，體外培養的樹鼩角膜內皮細胞可以在長期（至少P20代）的傳代培養過程中維持良好的細胞形態。
附圖說明
圖1是分離得到的樹鼩角膜內皮細胞不同時期生長狀態；其中A是消化後的細胞，B是4h後部分細胞貼壁，C是3d後細胞倍增生長，D是7d後大部分細胞融合。
圖2是樹鼩角膜內皮細胞的純化狀態；其中A是使用TGF-β抑制劑純化3d的樹鼩CECs，B是使用TGF-β抑制劑培養5d的樹鼩CECs，C是使用TGF-β抑制劑培養10d的樹鼩CECs，D是經TGF-β抑制劑純化過樹鼩CECs傳至P3代。
圖3是樹鼩角膜內皮細胞的形態學與免疫學鑑定情觀察結果；其中A是樹鼩CECs的蘇木精-伊紅染色（100X），B是樹鼩CECs的蘇木精-伊紅染色（400X），C是樹鼩CECs神經元特異性烯醇酶免疫螢光染色，D是對照組成纖維細胞NSE免疫螢光染色。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明。
（1）樹鼩角膜內皮原代細胞的分離：
將成年樹鼩死體的後彈力層完整撕下，加入3mL消化液，置於37℃的搖床上消化2h後以1500rpm離心10min，用培養液衝洗3次後重懸細胞，再以1500r/min離心10min，棄上清，加入5mL培養液吹打混勻後移至25cm2培養瓶中，將沉澱吹打混勻，在37℃、5%CO2的條件下培養25～30d至P5代，隔日換培養液，得到培養樣品；每間隔兩天在顯微鏡下觀察細胞形態並拍照記錄，見圖1；
所述消化液是含膠原酶75μg/mL、中性蛋白酶20μg/mL、DTT 0.5mg/mL和FBS 1%的DMEM低糖培養基；
培養液是經下列操作製得：將Ham’s F12培養液與M199培養液按1:1質量比混合，再加入5%FBS、20μg/mL抗壞血酸鈉、5μg/L胰島素、1%ITS（Insulin transferrin selenium）、100U/mL青黴素和100μg/mL鏈黴素，5ng/mL EGF(epidermal growth factor)，添加10μmol/L的TGF-β抑制劑（SB431542，Selleck），即得到培養液；
（2）樹鼩角膜內皮細胞的純化：
聯合使用差速消化法輔助細胞純化：將步驟（1）所得培養樣品，使用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液消化1～2min，顯微鏡下觀察到大部分成纖維細胞變圓、懸浮後用含10%FBS的DMEM/F12細胞培養液終止消化，反覆吹打後棄掉消化下來的細胞，再用PBS衝洗3次後添加培養液繼續培養，24h後全量換液，以後隔天換液；培養液同上；在顯微鏡下觀察細胞形態並拍照記錄，見圖2；
（3）CECs的傳代培養：
待步驟（2）培養的細胞生長至80%融合度後，用0.25%胰酶消化按1:2傳代培養，傳至P5代的角膜內皮細胞，用於樹鼩角膜內皮細胞鑑定，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態及生長狀況。
樹鼩角膜內皮細胞的鑑定：
用蘇木精-伊紅染色進行形態學鑑定：將步驟（3）傳至P5代的角膜內皮細胞接種至6孔板上，待角膜內皮細胞生長至80%融合度後，棄去培養液，使用4%甲醛溶液固定10min，再以PBS衝洗3次，蘇木精染色20s，PBS衝洗3～5次，伊紅負染10min；在相差顯微鏡下觀察細胞形態；
使用神經元特異性烯醇酶（NSE）免疫螢光染色進行鑑定：將培養至P5代的CECs融合至80%面積的細胞培養瓶，使用4%的甲醛溶液固定20min，PBS清洗3次，每次衝洗2min，再以0.5%的Triton-X100穿孔15min，PBS漂洗三次，然後用山羊血清封閉液封閉30min，PBS漂洗三次，再加入1%BSA稀釋的兔抗人神經元特異性烯醇酶（NSE）一抗（1:1000），4℃過夜，PBS漂洗三次，加入1%BSA稀釋的螢光標記的羊抗兔IgG（1:200），37℃孵育1h，PBS漂洗三次，抗淬滅封片劑封片，在螢光顯微鏡下觀察。
對成纖維細胞用相同方法進行免疫螢光染色，作為陰性對照。見圖3。
從圖1可知，使用揭膜-消化兩步法得到的角膜內皮細胞漂浮在培養液中，呈圓形，輪廓清楚，胞漿清亮。3～4h後見少許細胞已貼壁，有偽足伸出，呈不規則形。24h後大部分細胞已經貼壁，細胞形態不規則。第2～3d細胞生長活躍向四周擴展，部分細胞融合形成細胞群落。第7d大部分細胞融合，呈多邊形，邊界清楚，胞漿豐富。
從圖2可知，使用TGF-β抑制劑（SB431542，DMSO溶解）在抑制劑濃度為10μM，作用時間為10d的時候，對樹鼩雜質成纖維細胞的生長產生明顯可見的抑制作用，在傳至P3代細胞時可以實現角膜內皮細胞的純化。
從圖3的A和B可知，蘇木精-伊紅染色顯示細胞以多邊形為主，相互嵌合呈片狀單層，無角膜上皮細胞、基質細胞生長。圖3的C顯示樹鼩CECs的免疫螢光染色結果呈陽性，圖3的D為對照組成纖維細胞呈陰性結果。具有角膜內皮細胞的一般特徵。