封閉TGF－β1的反義寡核苷酸及其在製備治療纖維化相關疾病藥物中的用途的製作方法
2023-06-03 14:18:21
專利名稱：封閉TGF－β1的反義寡核苷酸及其在製備治療纖維化相關疾病藥物中的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程藥物領域，具體說是一種針對轉化生長因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，ASODN)的序列和結構及其成為預防纖維化產生、治療纖維化相關疾病的新型藥物。
背景技術：
組織纖維化是過多的細胞外基質在特定組織的聚集，最終可導致受累組織器官功能減低或喪失。在很多疾病中均可以觀察到組織纖維化的發生，例如，肺塵埃沉著病(包括矽肺、煤肺等)，其共同的發病機制是塵埃被吸入肺泡誘導巨噬細胞釋放出一些纖維化因子促進纖維母細胞增生和膠原形成，導致纖維化；在病毒性、酒精性、藥物性肝炎中均可觀察到纖維組織增生，尤以肝硬化最為明顯，此時肝組織已被增生的纖維組織改建，不易從形態結構上完全恢復正常；以手術區瘢痕形成為特徵的併發症使青光眼濾過術的失敗率高達15％～25％。減少纖維化的發生是臨床醫學需要解決的重要問題之一。
目前，臨床上抗組織纖維化的常用藥是皮質類固醇、5-氟尿嘧啶、絲裂黴素-C、鈣通道阻滯劑(如，維拉帕米、尼卡地平、三氟拉嗪)、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)等。但使用中存在一些問題，例如皮質類固醇對成纖維細胞作用有雙重性，低濃度時反而促進成纖維細胞增殖；5-氟尿嘧啶、絲裂黴素-C有很大的毒副作用；鈣通道阻滯劑能抑制成纖維細胞的增生和粘附，但並不能完全抑制膠原和細胞外基質的合成；t-PA是分子量70kD的大分子蛋白，在體內容易被降解且有免疫原性。所以，迫切需要開發特異高效的抗纖維化藥物。
纖維化病變的發生及發展有始動因素和效應因素兩種因素的協同作用，由於始動因素常不清楚，所以對纖維化病變的治療常以對抗效應因素為主。對抗效應因素的措施包括1)抑制炎性細胞的粘附、遷移、集聚和釋放致纖維化介質。2)採用影響膠原合成及代謝的藥物。雖然體外研究中相關藥物能對膠原合成及代謝的各個環節進行幹預，但在體內這些藥物往往因毒性過大而達不到理想的抗纖維化效果。3)阻斷致纖維化因子如PDGF、FGF、VEGF、TGF-β1等的活性。特別是封阻TGF-β1的活性是抗纖維化研究中最活躍的領域。
TGF-β1是具有多種生物學活性調節功能的細胞因子，除在胚胎發育、器官形成、免疫反應等生理過程中發揮重要的正向調控作用外，還是創傷後組織修復及組織纖維化過程中關鍵的早期調控分子，且與瘢痕形成關係密切(IhnH.Pathogenesis of fibrosisrole of TGF-beta and CTGF.Curr Opin Rheumatol，2002，14681-685)。TGF-β1是種具多種生物學活性調節功能的細胞因子，至少有5種異構體，TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3較為多見，存在於大多數哺乳動物的所有組織中，尤其在骨、肺、腎及胎盤組織中含量豐富。人TGF-β1的mRNA全長序列長2745nt，編碼區長1176nt(包括信號肽及112個胺基酸的成熟肽)。已證實無論何種誘發因素導致的器官纖維化病變，其共同特徵是病灶局部有大量的TGF-β1持續存在(Branton MH，Kopp JB.TGF-beta and fibrosis.Microbes Infect，1999，11349-1365.Wells RG.Fibrogenesis.V.TGF-betasignaling pathways.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2000，279G845-850)。TGF-β1作用於病灶處的靶細胞，通過以下途徑促進過量基質聚集1)增強細胞外基質分子如纖連蛋白、膠原及蛋白聚糖的生物合成。2)抑制金屬蛋白酶分泌並誘導蛋白酶抑制物合成，阻斷基質降解。3)調節作為細胞外基質受體粘附分子整合素的表達，促進細胞與基質的粘附和基質的沉積。4)通過自分泌作用方式誘導自身合成進一步放大上述生物學效應。
研究證明，組織器官的纖維化病變均與TGF-β1聚集相關。例如，慢性心肌纖維化時TGF-β1表達明顯增加且與纖維化病變呈正相關(Hao J，Ju H，Zhao S，et al.Elevation of expression of Smads 2，3，and 4，decorin and TGF-betain the chronic phase of myocardial infarct scar healing.J Mol Cell Cardiol，1999，31667-678)；TGF-β1在血管成形術後再狹窄的形成過程中呈持續的高表達，並且促進了損傷的血管平滑肌細胞增殖，細胞外基質的合成、分泌，使之在血管內膜大量沉積，從而導致血管內膜的增厚，再狹窄的形成(Kaji T，Yamada A，Miyajima S，et al.Cell density-dependent regulation of proteoglycansynthesis by transforming growth factor-beta(1)in cultured bovine aorticendothelial cells.J Biol Chem，2000，2751463-1470.Chen YM，Wu KD，TsaiTJ，et al.Pentoxifylline inhibits PDGF-induced proliferation of andTGF-beta-stimulated collagen synthesis by vascular smooth muscle cells.J MolCell Cardiol，1999，31773-783)；TGF-β1促進腎小球繫膜細胞I型膠原的合成，誘導腎纖維化的發生(Poncelet AC，de Caestecker MP，Schnaper HW，et al.Thetransforming growth factor-beta/SMAD signaling pathway is present andfunctional in human mesangial cells.Kidney Int，1999，561354-1365)；TGF-β1曾被認為有利於傷口癒合、是傷口癒合中必不可少的調控因子，而最新的研究結果顯示傷口局部內源性TGF-β1活性的喪失，並未阻礙傷口癒合，而是使癒合組織的顯微結構向著無瘢痕化方向演變，有利於傷口癒合，TGF-β1並不是傷口癒合過程中必不可少的、發揮正向調控作用的啟動因子，而是阻礙上皮化進程、導致瘢痕形成的負向因子(Davison SP，McCaffrey TV，PorterMN，Manders E.Improved nerve regeneration with neutralization of transforminggrowth factor-betal.Laryngoscope，1999，109631-635)。我們的研究結果顯示，使用TGF-β1抑制劑可降低傷口部位膠原的合成，並且使膠原的排列接近正常，減少瘢痕的形成(劉韌，朱旭東，謝琳，肖南.外源性裝飾蛋白(Decorin)在組織修復中對膠原形成的抑制作用.中國生化藥物雜誌，2002，23126-128)。
綜上所述，對抗TGF-β1在促進傷口癒合、減少瘢痕形成及防止組織纖維化病變中有著極其重要的意義。封阻TGF-β1活性現有的策略包括1)幹預配體TGF-β1水平及活性。2)利用受體拮抗劑阻斷TGF-β1與其II型受體的結合，阻止TGF-β1信號傳入靶細胞。3)幹預TGF-β1受體後信號傳遞途徑。在動物模型和體外實驗中應用上述策略，封阻TGF-β1活性已取得一些效果。除TGF-β1單克隆抗體外，只識別並結合TGF-β1的其他分子還未見報導。
ASODN通過與特定基因按鹼基互補原則結合即雜交，可在基因水平上特異性地阻斷基因的表達，被認為是一種很有希望的高選擇性和高效率的潛在的疾病治療藥物。1998年FDA已批准一種ASODN藥物在美國進入臨床(治療AIDS病人巨細胞病毒感染的視網膜炎的fomivivsen)，另有5-6種ASODN藥物在進行臨床實驗。隨著人類基因組計劃的深入，特別是後基因組計劃的實施，將會有越來越多的疾病相關基因及藥物作用靶標被發現。ASODN藥物作為基因為靶的新一代藥物將會發揮其更大的優勢。與大分子藥物或蛋白類藥物相比較，ASODN分子量較低，與靶分子結合時空間位阻小，無免疫原性，經修飾後穩定性良好，組織滲透能力強，顯示出誘人的臨床應用前景。
通過計算機聯網檢索，從1995年至今僅幾篇文獻涉及以ASODN封阻TGF-β1，在動物模型中成功地阻斷TGF-β1mRNA，使單側輸尿管梗阻部位的間質纖維化減少(Isaka Y，Tsujie M，Ando Y，et al.Transforming growthfactor-beta 1 antisense oligodeoxynucleotides block interstitial fibrosis in unilateralureteral obstruction.Kidney Int，2000，581885-1892)，以及促進皮膚傷口癒合減少瘢痕形成(Choi BM，Kwak HJ，Jun CD，et al.Control of scarring in adultwounds using antisense transforming growth factor-beta 1 oligodeoxynucleotides.Immunol Cell Biol，1996，74144-150)。國內研究者劉小菁和梁志清圍繞肝纖維化進行了一些工作，但是與國外同行一樣，他們使用的ASODN是針對TGF-β1mRNA編碼區的一段15-25mer的隨機序列，並不一定是靶基因上的最佳作用靶點(劉小菁.TGF-β1反義寡核苷酸對大鼠肝臟星狀細胞激活及其膠原生成的抑制作用.華西醫科大學學報，2000，1342-45.梁志清.反義核酸對大鼠肝纖維化轉化生長因子β受體表達的調節作用.中華實驗外科雜誌，1999，1644-45)。研究發現，雖然鹼基的組成可能會影響雜交雙鏈的形成，但是雜交雙鏈的理論自由能不同並不能解釋ASODN活性的巨大差別。RNA分子內鹼基配對形成的二、三級結構會造成大部分的分子不能與互補核酸相互作用；其他一些結構，如莖環結構、末端序列沒有分子內相互作用，但易與其它核酸結合。這證明互補的ASODN與靶基因結合的主要影響因素不是鹼基組成，而是RNA的二、三級結構。要詳細預測RNA的這些結構仍很困難，另外，細胞性因素對其影響也知之甚少。近幾年來，為減少ASODN的毒性、減少非特異性作用以及降低費用等，發展了許多方法以更詳盡地研究mRNA中的最佳靶點，從而尋找更有潛力和更有效的反義藥物。
SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)技術即通過指數型富集達到配基的系統性進化，由Tuerk和Gold於1990年首次發明使用(Tuerk C，Gold L.systematic evolution of ligands by exponential enrichment，RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.Science，1990，249505-510)。SELEX技術是應用大容量的隨機寡核苷酸庫，該寡核苷酸庫可為任何靶分子(包括蛋白、核酸、病毒、細菌、甚至金屬離子)提供足夠量的、且包納了所有可能空間結構的底物，並結合PCR體外擴增技術，以指數級富集與靶分子特異結合的寡核苷酸，獲得高親和力、高特異性的寡核苷酸配基。利用隨機寡核苷酸庫尋找靶分子的封阻劑或ASODN藥物已取得令人鼓舞的結果。
發明內容
本發明的目的在於即本發明的目的是提供對靶向TGF-β1基因具有良好抑制活性的ASODN以及能夠改善其生物學活性的化學修飾衍生物。本發明的另一個目的是提供所述封閉TGF-β1的反義寡核苷酸的化學修飾物在製備治療纖維化相關疾病藥物中的用途。
為實現上述目的採用的技術方案首先進行全長TGF-β1基因的製備、克隆及體外轉錄，其次構建隨機寡核苷酸庫，然後以TGF-β1mRNA為模板對隨機寡核苷酸庫進行多輪篩選，通過對篩選的寡核苷酸進行測序，確定了18條ASODN序列(見表1)。採用自動DNA合成儀合成上述序列並在合成時進行硫代修飾，通過抑制KB細胞的TGF-β1活性，對上述ASODN進行評價。發現其中8條序列即TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312在200nmol/L濃度時，對基因具有特異性的抑制活性，抑制率均在50％以上。進一步的藥效學研究表明，TGF554、TGF982、TGF1312的IC50分別為176.2nmol/L、140.2nmol/L、185.1nmol/L，大大低於文獻報導的序列。
表1 反義寡核苷酸序列及性質
A反義根據本發明，靶向TGF-β1編碼區的TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312能特異性地抑制TGF-β1基因的功能，有可能成為預防及治療纖維化相關疾病的新型生物工程藥物。
根據本發明，TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312的長度均為20個核苷酸。ASODN的長度與其細胞穿膜性、與靶序列結合的親和性及作用特異性等有關，TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312的長度根據實驗確定，本發明包含了與TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312具有相同序列的任何長度的寡核苷酸。
根據本發明，為增強ASODN的核酸酶耐受性、生物利用度、組織靶向性等，本發明包含了TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312的各種化學修飾，例如硫代修飾、半乳糖修飾、親脂分子或靶向脂質體修飾等。
根據本發明，本發明優選的抗纖維化ASODN序列TGF982。
根據本發明，本發明的ASODN及其修飾物可按本領域已知方法配成非腸道給藥製劑。
根據本發明，本發明的ASODN及其修飾物可單獨使用或組成組合物形式包括聯合其它ASODN及衍生物形式。
根據本發明，本發明的治療組成，依具體情況包括特定藥物的藥代動力學、給藥模式、給藥途徑、受者年齡、體重、肝腎功能狀態、疾病性質、程度及治療時限等，以合適的劑量用藥。
根據本發明，本發明的ASODN及其修飾物可用於製備應用於實驗室和臨床的TGF-β1檢測試劑盒。
本發明的實施對嚴重危害人類健康的纖維化相關疾病的預防及治療具有重要的社會效益核經濟效益。
結合附表
本發明的具體實施方法圖1為TGF-β1cDNA電泳圖譜；圖2為TGF-β1表達質粒構建示意圖；圖3為反義寡核苷酸的SELEX篩選過程；圖4為18條反義寡核苷酸序列對TGF-β1的抑制活性。
具體實施例方式
本發明的ASODN篩選及活性驗證方法的一些舉例性但非限制性的例子見下。
實施例一
1、TGF-β1mRNA的製備RT-PCR擴增含成熟TGF-β1蛋白及信號肽的cDNA片段，該cDNA長度為1.3kb，其5』端含Hind III酶切位點，3』端含XbaI酶切位點。經克隆至A/T載體中測序驗證為正確序列。分別對含目的片段的載體進行Hind III-Xba I雙酶切，回收基因片段；pSP64(polyA)載體(Promega)進行Hind III-Xba I雙酶切，回收後與上述基因片段進行連接過夜，得到含SP6啟動子的TGF-β1cDNA(811-2170)體外表達質粒pSP64-TGF-β1(見圖1)。該表達質粒的構建如圖2所示。以EcoR I酶切的線性化pSP64-TGF-β1為模板進行體外轉錄，回收mRNA後-70℃保存備用。
2、ssDNA隨機庫的設計及合成設計合成了1個ssDNA隨機庫，隨機序列長20個鹼基，翼長32個鹼基；由日本Espec Oligo Service Corp.公司合成，合成規模大於6nmol，全長序列98％以上。其具體組成為5』-accagcggactcgtgc-N20-cagacgactcgcccga-3』3、靶向TGF-β1mRNA的寡核苷酸篩選雜交反應體系總體積50μl，mRNA終濃度0.2-0.25μmol/L，隨機寡核苷酸庫的終濃度40μmol/L。隨機寡核苷酸庫預先100℃處理5min，迅速置於冰浴中至少10min。mRNA與隨機寡核苷酸庫在42℃雜交30min。柱吸附法回收mRNA(RNeasy Mini Kit，Qiagen)，洗滌5次後以50μl水洗脫。反義寡核苷酸的SELEX篩選過程見圖3。
4、ssDNA富集庫的製備以洗脫液為模板進行PCR擴增，上遊引物為5』-accagcggactcgtgc-3』，下遊引物為5』-Bio-Bio-Bio-tcgggcgagtcgtctg-3』。PCR反應體系總體積50μl，上下遊引物終濃度為2μmol/L，加入洗脫液8μl，採用HotStar Taq(Qiagen)。反應條件95℃預變性15min，94℃變性30s，52℃退火1min，72℃延伸2min，進行30個循環。8％變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，切膠純化52bp的擴增產物，作為ssDNA富集庫進行下一輪篩選。
5、反義寡核苷酸序列的聚類分析篩選4-6輪後，以洗脫液為模板進行PCR擴增，上遊引物為5』-accagcggactcgtgc-3』，下遊引物為5』-tcgggcgagtcgtctg-3』。PCR反應體系及擴增條件同(4)。取4μl PCR產物與T-easy Vector(Promega)在4℃連接過夜，轉化JM 109感受態菌，在塗有IPTG/x-gal的LB瓊脂板(Amp+)上培養12-18h。挑取分隔良好的白色菌落至5ml LB培養基(Amp+)中，37℃搖床培養18h。離心收集菌體，用質粒提取試劑盒進行質粒提取及純化。紫外定量後進行測序。採用聚類分析軟體就測序結果與mRNA序列進行比對分析，確定反義寡核苷酸序列。
實施例二1、TGF-β1mRNA的製備同實施例一。
2、ssDNA隨機庫的設計及合成設計合成了2個ssDNA隨機庫，隨機序列長17、26個鹼基，翼長20、32個鹼基；由日本Espec Oligo Service Corp.公司合成，合成規模大於6nmol，全長序列98％以上。
其具體組成為5』-accagcggactcgtgc-N26-cagacgactcgcccga-3』5』-accagcggac-N17-actcgcccga-3』3、靶向TGF-β1mRNA的寡核苷酸篩選同實施例一。
4、反義寡核苷酸序列的聚類分析同實施例一。
5、反義寡核苷酸的優化通過3個隨機寡核苷酸庫的篩選，發現隨機序列長20個鹼基，翼長32個鹼基的ssDNA庫結合效率最高，對TGF-β1mRNA的結合位點最明確。在對3次篩選進行比較分析後，確定了18條寡核苷酸序列，其中2條序列位於轉錄起始區，11條位於信號肽區，5條位於成熟肽編碼區。具體序列組成見表1。
實施例三1、合成硫代修飾的反義寡核苷酸序列自動DNA合成儀合成並在合成過程中進行硫代修飾，合成規模15OD，PAGE變性凝膠電泳後切膠純化。
2、反義寡核苷酸活性評價人口腔表皮癌細胞(KB)接種於96孔板，4×103細胞/孔，37℃、5％CO2孵育18-20h。60-80％細胞融合後，採用Opti-MEMI Reduced Serum Medium(Gibco)在無血清狀態下，脂質體Oligofectamin(Invitrogen)進行細胞轉染，總體積100μl，反義寡核苷酸終濃度為200nmol/L。將上述18條序列分別轉染KB細胞，作用5h後加50μl含6％胎牛血清的Opti-MEM I Reduced Serum Medium繼續培養24h。以單加培養基的細胞為空白對照，以單加脂質體的細胞為陰性對照，以單加文獻報導的靶向TGF-β1mRNA序列(5』-agggcggcatgggggaggc-3』)為陽性對照(Han DC，Hoffman BB，Hong SW，et al.Therapy with antisense TGF-β1 oligodeoxynucleotides reduceskidney weight and matrix mRNAs in diabetic mice.Am J Physiol Renal Physiol，2000，278F628-F634)。每次實驗中每1條硫代反義寡核苷酸序列均重複3孔，結果取其平均值。TGF-β1活性檢測採用Human TGF-β1Immunoassay Kit(RD)，按說明書進行操作。在酶標儀(BioRad)上檢測450nm處的吸收值。
3、結果表明18條反義寡核苷酸序列封阻TGF-β1活性的效率各不相同(見圖4)，其中8條序列經細胞學驗證活性好，3條序列活性較好，7條序列無效。結果提示封阻TGF-β1活性好的8條序列是TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312。
實施例四1.ASODN的設計及合成根據實施例三的實驗結果，選擇設計了8條硫代反義寡核苷酸及8條相應的正義寡核苷酸(見表2)。所有ASODN的合成及純化同前。
表2 硫代寡核苷酸的結構及性質
2.細胞培養及轉染KB細胞接種於96孔板，4×103細胞/孔，37℃、5％CO2孵育18-20h。60-80％細胞融合後，採用Opti-MEM I Reduced Serum Medium在無血清狀態下，脂質體Lipofectamin(Invitrogen)進行細胞轉染，總體積100μl，寡核苷酸終濃度為50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L、800nmol/L。將8條硫代反義寡核苷酸序列及8條硫代正義寡核苷酸序列分別轉染KB細胞，其餘操作同實施例三。每次實驗中每1條硫代序列的每個濃度均重複3孔，結果取其平均值。TGF-β1活性檢測採用Human TGF-β1Immunoassay Kit(RD)，按說明書進行操作。在酶標儀(BioRad)上檢測450nm處的吸收值。結果表明，正義寡核苷酸的最大抑制率＜20％，而反義寡核苷酸的抑制率呈劑量依賴地增加。當濃度為800nmol/L時，TGF554、TGF982、TGF1210的抑制率分別達到82.2％、83.4％、74.1％，結果見表3。
表3 反義寡核苷酸序列封阻TGF-β1活性
權利要求
1.與人轉化生長因子基因編碼區互補的寡核苷酸及其化學修飾物，其中，所述寡核苷酸的長度為10-30個鹼基並包含下列序列的寡核苷酸反義寡核苷酸序列及性質
2.根據權利要求書1所述的寡核苷酸，其特徵是，其最佳序列為TGF554、TGF982及TGF1210。
3.根據權利要求書1所述的寡核苷酸的化學修飾物可以是硫代修飾、半乳糖修飾、親脂分子或靶向脂質體修飾的修飾物。
4.如權利要求書1或3所述的寡核苷酸化學修飾物在製備用於預防及治療纖維化相關疾病非腸道給藥藥物製劑上的用途。
全文摘要
本發明針對轉化生長因子基因序列，採用SELEX技術篩選、合成的18種反義寡核苷酸，可用於抑制轉化生長因子的基因表達，達到預防及治療纖維化相關疾病的目的。本發明採用體外培養的高表達轉化生長因子的人口腔表皮癌細胞，對18條互補於轉化生長因子編碼區的反義寡核苷酸進行了活性篩選及評價，首次發現寡核苷酸TGF252、TGF348、TGF471、TGF554、TGF982、TGF1000、TGF1210、TGF1312及其化學修飾物在培養細胞中能有效地抑制轉化生長因子基因的表達。故本發明涉及到針對轉化生長因子的反義寡核苷酸的序列與結構及其成為預防纖維化產生、治療纖維化相關疾病的新型藥物。
文檔編號A61P1/16GK1718585SQ20051005701
公開日2006年1月11日 申請日期2005年4月12日 優先權日2005年4月12日
發明者劉韌, 朱旭東, 謝琳, 王正國 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學野戰外科研究所