一種表達人抗體全基因的重組腺病毒(rAdv)載體及其方法

2023-05-27 11:11:31

專利名稱：一種表達人抗體全基因的重組腺病毒(rAdv)載體及其方法
技術領域：
本發明涉及分子藥物和基因治療領域，具體而言，利用rAdv穿梭表達載體PDC316構建高效表達人抗體全基因的rAdv載體表達系統，在具體應用中將不限於本研究中所使用的載體及抗體基因。該表達系統不僅在細胞水平上有很好表達抗體的效果，而且在哺乳動物體內短期就有很高的表達，本發明為rAdv載體表達抗體全基因在抗體治療、腫瘤治療和新型抗體疫苗體內表達的研究提供了重要基礎，也為我國新型中和抗體基因疫苗的研究提供了新方向。
背景技術：
抗體(Antibody)指機體的免疫系統在抗原刺激下，由B淋巴細胞或記憶細胞增殖分化成的漿細胞所產生的、可與相應抗原發生特異性結合的免疫球蛋白，抗體具有特異性強、副作用小、免疫原性低、生物活性單一等特點，由於其獨有的特徵已迅速應用於生物學和醫學的很多領域。目前世界上有30多個抗體藥物已經獲得批准上市，主要集中在腫瘤、自身免疫性疾病和感染類疾病等方面。目前應用的抗體藥物的種類主要有鼠源性抗體、人-鼠嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體，鼠源性抗體由於能夠誘發人體產生人抗鼠抗體、半衰期短，引起過敏反應和超敏反應等缺點，影響其在腫瘤、器官移植等疾病和的診斷和治療上的應用。人-鼠嵌合抗體和人源化抗體由幹與抗原的結合能力弱，長時間使用能誘發人體產生人抗鼠抗體也是其應用受到限制，而人抗體具有更低的免疫原性、更好的安全性、更慢的清除周期，目前抗體藥物的發展主要方向是向全人抗體發展，有的抗體在臨床治療比較成功，但對於抗體的廣泛應用還是受到生產能力的限制，提高抗體全基因的表達效率，包括在體內的基因治療和體外哺乳細胞的大量表達等方面都將產生重要的意義。當前，我國表達載體和細胞株改造都遠遠落後於歐美國家，所以治療性抗體藥物重點解決的問題之ー是建立高效表達抗體基因的載體。抗體的基本結構相似，都是由兩條相同的重鏈(H鏈)和兩條相同的輕鏈(L鏈)通過ニ硫鍵連接而成，將重鏈和輕鏈構建在載體上進行高效的表達是關鍵所在，這樣就涉及到雙基因共表達的構建策略。雙基因共表達的構建策略主要有以下幾個方面(I)雙啟動子的構建策略，這種策略是用雙表達盒表達兩個基因，用各自獨立的啟動子轉錄不同的基因，啟動子可以ー樣也可以不一樣，載體上有兩個啟動子和兩個PolyA。這種構建策略的缺點是內部啟動子佔用了載體上有限的克隆空間，為了增加克隆空間可以用兩個啟動子和ー個PolyA的構建方案，這兩種方案在不同的載體中轉錄效果也不盡相同。真核載體常用的啟動子有CMV、EF-la、hPGK、CAG、mPGK等，不同啟動子有不同的轉錄效率，同時在不同組織中轉錄的效率也不盡相同；(2)引入IRES的構建策略，兩個基因之間插入內核糖體插入位點(internal ribosomal entry site, IRES)序列使其為同一啟動子驅動而轉錄為單個mRNA,但翻譯為兩種不同的蛋白質。這種構建方案能夠避免雙啟動子轉錄時的相互幹擾，但置於IRES下遊基因表達量遠遠比上遊基因表達量的效率低很多；(3)融合表達的構建策略，用連接肽(linker)將兩個基因相連，在ー個啟動子調控下翻譯出具雙功能的融合蛋白分子，但對於抗體來說需要輕、重鏈分別表達才能組裝成功能和立體結構完整的IgG。除此之外還有供體/受體位點剪切構建策略、Furin切割構建策略、2A序列自我切割構建策略等，這些構建策略由於在體內切割效率低，兩基因的表達效率也 很不穩定，還有部分剪切的調節機制還都不清楚。在抗體藥物治療和應用中，很重要的一點是要提高抗體的表達量，同時也要避免啟動子相互幹擾，以免造成不同基因表達水平的不一致。抗體全基因的表達，由於輕鍊表達量大於重鍊表達量才能更好更多的組裝成完整的抗體，所以應該嘗試多種雙基因載體構建的方案，而且不同的構建方案在不同的載體在表達抗體吋，其表達效率不盡相同。基於以上理論，為建立Adv載體高效表達抗體全基因技術平臺。我們在專利「一種表達人抗體全基因的重組腺相關病毒(rAAV)載體及其方法」(申請號201210106947. I)的基礎上採用了多種雙基因表達策略並獲得ー種高效表達抗體全基因的最佳方案。腺病毒(adenovirus, Ad)無包膜,夕卜殼是ー個二十面體結構，由240個六面體和12個五鄰體構成；內部有約36kb的線性化雙鏈基因組，分為100個圖距単位。近年來，研究者們已對腺病毒六鄰體蛋白的結構、功能進行了廣泛的研究。按病毒複製的時間，可將基因組分為早區(E區)及晚區(L區)前者包括E1、E2、E3、E4，編碼病毒調節蛋白及功能蛋白；後者分為LI、し2、L3、L4、L5,編碼病毒結構蛋白。目前對腺病毒的分子生物學特性研究得最為詳細的是人腺病毒2型(Ad2)和人腺病毒5型(Ad5)，目前絕大多數編碼有潛在治療作用的基因載體是用Ad5構建的。腺病毒載體具有很多優點(I)宿主範圍廣泛，可感染人和多種哺乳動物。既可感染分裂期細胞，也可感染靜止或終末分化細胞；(2)感染滴度高。在293細胞中増殖的重組腺病毒滴度可高達到lO'fu/ml ; (3)安全性高。腺病毒活疫苗在美國軍隊使用ニ、三十年，證明是安全有效的；(4)產生的大量外源蛋白質接近於翻譯後水平的成熟蛋白質，即磷酸化和糖基化；(5)穩定性好。-80°C可保存多年，凍幹後不需冷藏；(6)應用方便。根據不同需要，可選擇ロ服、滴鼻或氣管、靜脈、腹腔內、皮下或肌肉途徑。由於腺病毒載體具有以上的優點，腺病毒載體在近年來被廣泛應用的真核基因運載工具，因而已在基因工程疫苗研製和基因治療中顯示出巨大的潛在應用價值。重組腺病毒載體的構建策略有3種①在細胞內同源重組，產生重組腺病毒將純化的腺病毒全長DNA和外源基因同時插入帶有腺病毒基因片段的穿梭質粒中，將腺病毒DNA和重組質粒共轉染包裝293細胞，隨機重組成腺病毒基因組，進一歩包裝成病毒顆粒，該方法病毒產量低，隨機性強，效率較低；②將腺病毒全長DNA序列克隆入穿梭質粒中，轉化感受態大腸桿菌，在細菌中複製腺病毒DNA序列，然後將外源基因片段插入有抗性基因的真核表達質粒，將重組真核質粒線性化後，轉化帶穿梭質粒的大腸桿菌，在細菌Cre重組酶的作用下，大腸桿菌發生同源重組，將外源基因表達盒插入腺病毒DNA中，用該方法可構建缺失任何區段的腺病毒DNA ;③將稀有的限制性內切酶位點引入穿梭質粒和腺病毒骨架載體中，將外源基因克隆入穿梭質粒中，通過酶切連接的方法，將外源基因克隆入腺病毒骨架載體，轉化大腸桿菌複製重組質粒，轉染相應的包裝293細胞系後，即可產生複製缺陷型的重組腺病毒，該方法效率很高，因而得到較廣泛的應用，在目前基因治療研究中較多見。AdMaxTM腺病毒系統是由腺病毒載體鼻祖Dr. Frank Graham在1999年創建的一套重組腺病毒構建系統，該系統基本原理是通過Cre-IoxP或FLP-frt重組酶，使共轉染到293細胞中的腺病毒載體穿梭質粒和輔助質粒(腺病毒基因組質粒)在重組酶的作用下產生重組腺病毒。得到的重組病毒是E1/E3缺失的複製缺陷型腺病毒。

發明內容
本發明目的是提供 利用Adv載體系統構建包含人抗體重鏈和輕鏈全基因的高效雙基因表達系統。本發明以HIV人中和抗體2G12全基因為模型，利用Adv5型穿梭表達載體pDC316 (Microbix Biosystems公司，參見
權利要求
1.一種表達人抗體全基因的重組腺病毒(rAdv)載體，其特徵在於，利用Adv5型穿梭表達載體PDC316構建而成。
2.如權利要求I所述的重組腺病毒(rAdv)載體，其特徵在於該載體的功能區段構成為promoterl—murine IgGl signal peptide—目的抗體 L chain—promoter2—murineIgGl signal peptide-目的抗體 H chain—SV40 polyA—LoxP—ColE ori---Ampicillinresistance。
3.如權利要求1、2所述的重組腺病毒(rAdv)載體，其特徵在於在PDC316的基礎上具有 5 -ITR-promoterl-murine IgGl signal peptide-L chain-promoter2_murine IgGlsignal peptide-H chain_SV40 polyA-ITR-Ampicillln resistance-ColE ori_SV40 啟動子-neo_SV40Ploy A的基因結構單元。
4.如權利要求2或3所述的重組腺病毒(rAdv)載體，其特徵在於所述的promoterl為hEF_l a promoter ;所述的 promoter2 為 hCMV IE promoter0
5.如權利要求1-4所述的重組腺病毒(rAdv)載體，其特徵在於，該載體為PDC316/eLcH，所表達的抗體為HIV人中和抗體2G12全基因。
6.—種構建表達人抗體全基因的重組腺病毒(rAdv)載體的方法，其具體構建方法為 1)通過PCR的方法改造pDC316，並在載體pDC316的多克隆位點插入linker； 2)利用PCR 技術擴增出 hEF-1 a promoter、murine IgGl signal peptide、目的抗體的輕鏈、hCMV IE promoter、murine IgGl signal peptide、目的蛋白的重鏈、SV40 polyA等基因結構單兀； 3)利用酶切位點將步驟2)中各結構單元順次連接，克隆到改造好的PDC316載體的多克隆位點中，形成 5 『-ITR-promoter lmurine IgGl signal peptide-Lchain-promoter2_murine IgGl signal peptide-H chain_SV40 polyA-ITR 的基因結構單元; 4)即得到重組腺病毒(rAdv)的穿梭表達載體。
7.權利要求6所述的方法，其特徵在於步驟4)中所述的載體為權利要求5所述的pDC316/eLcH0
全文摘要
本發明涉及分子藥物和基因治療領域，具體而言，利用rAdv穿梭表達載體pDC316構建高效表達人抗體全基因的rAdv載體表達系統，該表達系統不僅在細胞水平上有很好表達抗體的效果，而且在哺乳動物體內短期就有很高的表達，還可持續長期的表達，本發明為rAdv載體表達抗體全基因在抗體治療、腫瘤治療和新型抗體疫苗體內表達的研究提供了重要基礎，也為我國新型中和抗體基因疫苗的研究提供了新方向。
文檔編號C12N15/66GK102690842SQ20121019257
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月12日 優先權日2012年6月12日
發明者餘雙慶, 馮霞, 周玉柏, 曾毅, 管永軍, 賈潤清 申請人:北京工業大學, 曾毅, 管永軍, 賈潤清