含鼠lgG2aFc標籤的真核表達載體及其構建方法
2023-05-27 14:39:06
含鼠lgG2a Fc標籤的真核表達載體及其構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種含鼠lgG2a?Fc標籤的真核表達載體及其構建方法，構建方法為：將mIgG-Fc序列和pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌，篩選得到重組載體mIgG-Fc-pMD18-T；將重組載體mIgG-Fc-pMD18-T和pcDNA3.1+質粒分別用Not?I和Xba?I進行雙酶切，將分離純化後的酶切產物進行連接，轉化大腸桿菌，篩選獲得含鼠lgG2a?Fc標籤的真核表達載體。該載體可以在哺乳動物細胞中表達目的蛋白，並通過小鼠IgG?Fc作為標籤，用抗小鼠IgG?Fc的抗體即可檢測，表達的蛋白液可以用ProteinA或Protein?G的親和柱純化，以用於後續蛋白質活性的鑑定。
【專利說明】含鼠lgG2a Fe標籤的真核表達載體及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於載體構建領域，具體地說，本發明涉及一種含鼠lgG2a Fe標籤的真核表達載體及其構建方法。
【背景技術】
[0002]通過基因重組技術生產有價值的外源性蛋白質是當今生物技術研究與開發的熱點之一。微生物、植物、動物都可以作為蛋白質的表達系統，但由於每一類表達系統都有其自身的特點和適用範圍，並且不同的目的蛋白結構不同，並受其產率和蛋白的可溶性、穩定性、分子量大小的制約，因此如何選擇高效的表達系統就顯得尤為重要。
[0003]大腸桿菌表達系統是基因表達技術中發展最早、目前應用最廣泛的經典表達系統，是分子生物學產業化發展的重要工具。此系統具有遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達量高、表達產物容易純化、穩定性好、抗汙染能力強以及適用範圍廣等優點；但同時該表達系統也有明顯的缺陷，如表達產物(蛋白質)缺少翻譯後修飾，高表達時易摺疊錯誤導致表達產物沒有活性，而且大腸桿菌本身含有內毒素和有毒蛋白，可能混雜在終產物裡，導致在醫藥方面的使用受到局限。許多真核蛋白的表達過程還需要有翻譯後修飾，如單鏈修剪、糖基化、磷酸化和醯基化等，E.coli表達重組蛋白易於形成包涵體，限制了有活性產物的產量。
[0004]畢赤酵母是近年來流行的原核和真核蛋白質的表達載體。它具有表達率高、遺傳穩定、產物可分泌、發酵工藝成熟等優點。畢赤酵母能使外源真核基因正確翻譯和翻譯後加工，並能對許多蛋白質產物進行分泌，有利於蛋白的分離純化，能適應工業化生產的需要，易培養、繁殖快，遺傳背景清楚，便於進行遺傳操作；而且酵母毒性比細菌小，安全可靠，已長期廣泛應用於釀酒和食品工業，因此酵母作為基因表達系統特別是在大分子真核生物基因研究方面得到日益廣泛的應用。但是，由於通過酵母表達系統表達的外源蛋白質可能形成聚合體而影響表達效率，其信號肽加工不完全或蛋白質的內部降解等，可造成表達產物的差異，產生極不均一的現象，為表達產物純化和工業化生產帶來了困難。
[0005]昆蟲表達系統是一類應用廣泛的真核表達系統，它具有同大多數高等真核生物相似的翻譯後修飾加工以及轉移外源蛋白的能力。利用雙鏈DNA病毒感染昆蟲作為宿主，因為缺少脂多糖(為毒性物質)，可分泌大量蛋白質到培養基中，使得後續的純化更容易，可應用於抗生素和胞外水解酶的生產。但昆蟲表達系統受到諸多因素的限制和影響，如培養基質量、供氧情況、保證對數生長等；此系統的主要缺點是外源蛋白表達處於極晚期病毒啟動子的調控之下，而這時由於病毒感染，細胞開始死亡。解決辦法是適當的啟動子調控下的基因穩定轉化。另一類新型的昆蟲表達系統是建立在對果蠅等昆蟲細胞進行穩定轉化的基礎上的，在穩定和表達效率方面有更為突出的優點。
[0006]植物能夠表達來自動物、細菌、病毒以及植物本身的蛋白質,易於大規模培養和生產，且在基因表達與修飾及安全性方面有特別的優勢，因此利用植物生產外源蛋白質的研究展現了極其誘人的前景。人類有悠久的植物栽培史，在栽培、繁育、開發植物資源方面已形成較為完備的理論與技術體系。這一系統僅需要適宜的植物及其生長條件，省卻了昂貴的發酵設備及廠房投資，免去了培養基和能源的消耗，可以實現低投入與高產出。利用組織特異性、誘導性調控元件、信號肽序列可以使此系統有更好的靈活性與實用性。
[0007]哺乳動物細胞表達重組蛋白質的特點是表達產物不需要再摺疊，合成是連續的，可完成翻譯後修飾。由CH0(Chinese hamster ovary中國倉鼠卵巢細胞)分泌的蛋白質無需摺疊，缺點是表達水平低或產物不穩定。外源基因在哺乳動物中的表達可分為:①病毒介導的表達，②外源基因在哺乳動物中的瞬時表達，③外源基因在哺乳動物中的穩定表達，④轉基因動物，⑤核酸免疫等。表達載體的選擇取決於:①外源基因導入的方法，②mRNA表達及蛋白質合成的調控元件。在選擇穩定序列表達之前先進行瞬時表達研究，以鑑定整個系統是否適合外源蛋白的表達。基因工程嵌合抗體通常用COS細胞進行瞬時表達，病毒感染的中國倉鼠卵巢細胞(CHO-Kl)細胞系通常也用於蛋白的瞬時表達。採用異源啟動子、增強子和可擴增的遺傳標記，可提高蛋白產量。此系統在蛋白的起始信號、加工、分泌、糖基化方面具有獨特優勢，因此適合表達完整的大分子蛋白，但哺乳動物表達系統構成複雜、操作技術要求高、表達產量不大、產率低，且有時會導致病毒感染。
[0008]哺乳動物表達系統在蛋白的起始信號、加工、分泌、糖基化方面具有獨特優勢，因此適合表達完整的大分子蛋白。目前常用的表達載體有PCDNA3.1+/-、pCE4、pCMV/Zeo、pCMV/myc/ER等。Invitrogen公司的pcDNA3.1+為最常見的真核表達載體之一,可在真核細胞中高水平的穩定表達目標蛋白。該載體具有Ampicillin、Neomycin的抗性,可同過抗生素篩選陽性克隆。但由於這個載體不具有鑑定的標籤，表達的蛋白需要購買相應的特異性抗體用於檢測，因此，給使用帶來一定的不便。
【發明內容】
[0009]基於此，本發明提供了一種含有鼠IgG2a的Fe標籤的真核表達載體的構建萬法。
[0010]一種含有鼠lgG2a Fe標籤的真核表達載體的構建方法，包括以下步驟:
[0011](I)將mlgG-Fc序列和pMDlS-T載體連接，轉化大腸桿菌，篩選得到重組載體mlgG-Fc-pMD 18-T ；
[0012](2)將重組載體mIgG-Fc-pMD18-T和pcDNA3.1+質粒分別用Not I和Xba I進行雙酶切，將分離純化後的酶切產物進行連接，轉化大腸桿菌，篩選獲得含鼠lgG2a Fe標籤的真核表達載體mIgG-Fc_pcDNA3.1+。
[0013]在其中一個實施例中，所述mlgG-Fc序列是通過以下步驟製備得到的:
[0014](a)以小鼠脾臟總RNA為模板，反轉錄合成cDNA第一鏈；
[0015](b)以cDNA第一鏈為模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2為擴增引物，進行梯度PCR擴增，純化，得到mlgG-Fc序列；其中鼠lgG2a的Fe段基因的引物是根據GenBank:AB097847.1 序列設計得到的，上遊引物為:GAATGCGGCCGCATGCAGTCCATCACCTGCAATGTGG (SEQID NO:1)，含有 Not I 酶切位點；下遊引物為:TGCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAG(SEQID NO:2)，含有Xba I酶切位點和終止密碼子。
[0016]在其中一個實施例中，步驟(b)中所述梯度PCR擴增的反應體系為:
[0017]
【權利要求】
1.一種含鼠lgG2a Fe標籤的真核表達載體的構建方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)將mlgG-Fc序列和pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌，篩選得到重組載體mlgG-Fc-pMD 18-T ； (2)將重組載體mIgG-Fc-pMD18-T和pcDNA3.1+質粒分別用Not I和Xba I進行雙酶切，將分離純化後的酶切產物進行連接，轉化大腸桿菌，篩選獲得含鼠lgG2a Fe標籤的真核表達載體。
2.根據權利要求1所述的含鼠lgG2aFe標籤的真核表達載體的構建方法，其特徵在於，所述mlgG-Fc序列是通過以下步驟製備得到的: (a)以小鼠脾臟總RNA為模板，反轉錄合成cDNA第一鏈； (b)以cDNA第一鏈為模板，SEQID NO:1和SEQ ID NO:2為擴增引物，進行梯度PCR擴增，純化，得到mlgG-Fc序列。
3.根據權利要求2所述的含鼠lgG2aFe標籤的真核表達載體的構建方法，其特徵在於，步驟(b)中所述梯度PCR擴增的反應體系為:
4.根據權利要求1-3任一項所述的含鼠lgG2aFe標籤的真核表達載體的構建方法,其特徵在於，所述大腸桿菌為大腸桿菌DH5ci。
5.權利要求1-4任一項所述的的構建方法構建得到的含鼠lgG2aFe標籤的真核表達載體。
【文檔編號】C12N15/66GK103911387SQ201310005728
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年1月8日 優先權日:2013年1月8日
【發明者】萬曉春, 林婷婷, 向軍儉, 王蒲 申請人:深圳先進技術研究院