雞肉、牛肉、豬肉和馬肉多重pcr快速檢測試劑盒及其應用的製作方法

2023-05-27 02:00:36

專利名稱：雞肉、牛肉、豬肉和馬肉多重pcr快速檢測試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學檢測領域，發明公開了 一種同時檢測雞 肉、牛肉、豬肉和馬肉的多重PCR的方法的和檢測試劑盒。
背景技術：
雞肉、牛肉、豬肉和馬肉具有很高的營養價值，含有優質蛋白和 多種必需胺基酸，是人類飲食中的重要食品。但隨之巿場經濟的開放 搞活，人們的膳食結構也在不斷改變，肉類需求不斷增加，部分經營 人員用馬肉充當牛肉和豬肉及其加工品的現象經常發生。近幾年世界 上流行一些關於肉製品的特殊的病，英國的狂牛症，臺灣的豬口蹄疫， 金門島的牛口蹄疫，馬來西亞流行日本腦炎(已有51人喪生)，馬來 西亞政府決定宰殺疫區十萬頭豬。國內部分地區也有發生豬和牛的口 蹄疫，而後又有亞洲的禽流感，弄得人心慌慌，不少人害怕吃雞肉、 豬肉和牛肉。我國是一個多民族組成的國家，各種宗教習慣使得人們 的飲食有所差異，對肉類的選擇具有一定的傾向性。例如，回族不吃 豬肉，藏族不吃馬肉。同時一些特殊人群如患有高血壓、脂肪肝等的 患者對肉的選擇具有特殊性。另外，消費者對肉摻偽現象的也深惡痛 絕，然而由於以往釆用的法規檢測方法試驗手段比較落後，試驗周期 較長，所以這種摻偽現象屢禁不止。
為了保護消費者的利益和進出口貿易的公平，對雞肉、牛肉、豬肉和 馬肉進行檢測具有重要的社會和經濟意義。傳統的肉品檢測採用感官
檢驗和免疫學方法僅對其生鮮肉具有一定鑑別作用，但對加工處理的 肉製品，由於其感觀形狀，蛋白質成分和其他免疫原性物質被破壞， 難以鑑別，這給雞肉、牛肉、豬肉和馬肉的交易和進出口帶來了極大 的不便。隨著我國加入世界貿易組織進程的推進，國際貿易量與曰俱 增。因此，急需建立一種快速、準確、簡便的肉品檢驗方法。而同時 檢測肉品的技術更是具有重要的意義。

發明內容
本發明的目的在於提供一種簡單、快速、特異性強、靈敏度高的 能夠同時檢測雞肉、牛肉、豬肉和馬肉四種肉的方法。本發明提供了 一種同時檢測雞肉、牛肉、豬肉和馬肉四種肉的試劑盒其特徵正在於 含有以下引物
對雞肉、牛肉、豬肉和馬肉進行擴增時所需要的通用正向引物 Common-F: 5' -gacctcccagctccatcaaacatctcatcttgatgaaa-3' 對雞肉進行擴增時所需要的反向特異性引物 Chicken-R: 5' -ccttccttccttcccccccagatgaagaagaatgaggcg-3'
對牛肉進行擴增時所需要的反向特異性引物
Beef-R.- 5 ，-ccttccttccttccccccctagaaaagtgtaagacccgtaatataag-3"
對豬肉進行擴增時所需要的反向特異性引物 Pork-R: 5,-ccttccttccttcccccctgatagtagatttgtgatgaccg -3'
對馬肉進行擴增時所需要的反向特異性引物 Horse-R: 5'-ccttccttccttcccccccagattcactcgacgagggt -3" 進行多重PCR擴增時所需要的反向通用引物 Common-R: 5，-cct tccttccttccccccc-3，
本發明所述試劑盒中各項組分的終濃度分別為檢測雞肉、牛肉、
豬肉和馬肉的Common-F引物終濃度為15pmo1/uL， Common-R的引 物終濃度為15pmol/iuL,雞肉、牛肉、豬肉和馬肉特異性反向引物終 濃度分別為0.015pmol/mL; Mg2+濃度為1.5mmol/L; dNTP 0.2 mmol/L; 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0); 50 mmol/L KC1; Taq DNA聚 合酶2U;用雙蒸水補足體積至30jaL。
本發明還提供了一種檢測方法，它包括如下步驟
1) 將模板DNA加入權利要求的1所述的試劑盒中；
2) 多重PCR在ABI2720PCR儀上進行，具體參數設置如下 95'C預變性5min;
95 ℃ 30s，70。C 10s,60℃ 30s，72℃ 30s, 10個循環； 95。C30s, 60°C30s,72°C30s,25個循環； 72℃延伸7min。
3) 將擴增產物進行瓊脂糖凝膠(2.5%)電泳檢測。電泳後擴增的特 異性條帶分別為雞肉239bp、牛肉292bp、豬肉412bp、馬肉451bp。
本發明所述試劑盒的優點
1) 多重PCR方法操作簡單，與四種肉的單重PCR方法一樣具有良 好的特異性，它對四種肉的加工製品具有廣泛的適應性。
2) 多重PCR檢測與四種肉的單重PCR方法一樣具有具有較高的靈 敏度，可以檢測出痕量的DNA模板。
3 )該方法可以用於開發同時檢測其他多種肉品的試劑盒。


圖1:本發明試劑盒檢測結果圖
M: 100bpDNA Marker; 1:空白對照；2， 3， 4, 5:多重PCR單一檢測出雞肉、牛肉、豬肉、馬肉；6:多重PCR同時檢測出雞肉和牛肉；
7:多重PCR同時檢測出雞肉和豬肉；8:多重PCR同時檢測出雞肉和
馬肉；9:多重PCR同時檢測出牛肉和豬肉；10:多重PCR同時檢測
出牛肉和馬肉；11:多重PCR同時檢測出豬肉和馬肉；12:多重PCR
同時檢測出雞肉、牛肉和豬肉；13:多重PCR同時檢測出雞肉、牛肉
和馬肉；14:多重PCR同時檢測出雞肉、豬肉和馬肉；15:多重PCR
同時檢測出牛肉、豬肉和馬肉；16:多重PCR同時檢測出雞肉、牛肉、
豬肉和馬肉。
具體實施方案
1、肉模板DNA的製備
雞肉、牛肉、豬肉和馬肉每種各取2.0g，剪碎後加入液氮，研磨 成粉末狀，移入裝有10ml TESR[50mmol/L Tris-HCl pH8.0 50mL, 5mmol/LEDTA(二乙胺四乙酸二鈉)pH8.0, 1％SDS(十二烷基 黃酸鈉)，50mmol/LNaCl高溫滅菌後置室溫下，臨用時加入RNA酶 (20mg/L)]的50ml離心管中，混勻後置37℃溫育2 - 3h。離心(4 。C， 12000r/pm,10min)取上清，加入等體積的酚氯仿異戊醇(25: 24: 1)，反覆抽提兩次，再用氯仿/異戊醇(24: 1 )抽提一次。等體 積異丙醇沉澱DNA, 70 %乙醇洗滌數次，用TE(Tris-HCl和 EDTA,pH8.0)液溶解並於-20℃保存備用。
2. 多重PCR反應
以提取的待檢樣品的基因組為模板按以下比例進行多重PCR反
應檢測雞肉、牛肉、豬肉和馬的Common-F引物終濃度為15pmo1/ )iL，Common-R的引物終濃度為15pmol/|uL，雞肉、牛肉、豬肉和馬 肉特異性反向引物終濃度分別為0.015pmol/juL; Mg2+濃度為 1.5mmol/L; dNTP 0.2 mmol/L; 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0); 50 mmol/L KC1; TaqDNA聚合酶2U;用雙蒸水補足體積至30 n L。待檢樣品模 板基因組分別為25ng，用無菌水補足體積至30jLiL樣品。
多重PCR反應在ABI2720中進行，具體的參數條件如下95°C
。C30s,72。C30s,25個循環；72。C延伸7min。
3、 PCR擴增產物的鑑定
用lxTAE緩衝液配置成2.5%的瓊脂糖凝膠溶液，微波爐加熱 使瓊脂糖完全溶解後加入Golden view (5mg/mL)至終濃度為0.5 pg/ mL，倒膠然後取適量待電泳的PCR產物與1/6體積的電泳上樣液 (0.25%溴酚藍;0.25。/o二甲苯青FF; 40%蔗糖)混勻，將PCR產物 加到上樣槽中，在120V/cm電壓下進行恆壓電泳。當樣品電泳至適 當的位置後，在紫外凝膠成像系統(Bio-Rad，Gel Doc2000 )觀察結果 並拍照記錄。電泳後擴增的目的片段為雞肉239bp、牛肉292bp、豬 肉412bp和馬肉451bp。有以上片段則認為檢驗出陽性結果，無此片 段則認為檢測結果為陰性。
4、 PCR擴增產物的序列鑑定
利用DNA回收試劑盒(大連寶生物公司)從瓊脂糖凝膠中回收PCR產物進行克隆和(PGEM-Tvector)和DNA序列測定。DNA序列測定由上海聯合基因公司完成。
權利要求
1、雞肉、牛肉、豬肉和馬肉多重PCR快速檢測試劑盒及其應用，其特徵在於經過一次簡單的多重PCR可以達到同時檢測雞肉、牛肉、豬肉和馬肉的目的。
2、 根據權利要求l所述雞肉、牛肉、豬肉和馬肉多重PCR快速檢測 試劑盒及其應用其特徵在於，在進行多重PCR時對雞肉、牛肉、豬 肉和馬肉進行擴增時所需要的通用正向引物Common-F: 5 ，-gacctcccagctccatcaaacatctcatcttgatgaaa-3'對雞肉進行擴增時所需要的反向特異性引物 Chicken-R: 5' -ccttccttccttcccccccagatgaagaagaatgaggcg-3'對牛肉進行擴增時所需要的反向特異性引物Beef-R: 5 ，-ccttccttccttccccccctagaaaagtgtaagacccgtaatataag-3 ，對豬肉進行擴增時所需要的反向特異性引物 Pork-R: 5，-ccttccttccttcccccctgatagtagatttgtgatgaccg -3，對馬肉進行擴增時所需要的反向特異性引物 Horse-R: 5，-ccttccttccttcccccccagattcactcgacgagggt -3' 進行多重PCR擴增時所需要的反向通用引物 Common-R: 5，-cct tccttccttccccccc-3，。
3、 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於各組分的終濃度分 別為檢測雞肉、牛肉、豬肉和馬的Common-F引物終濃度為15pmo1/ uL,Common-R的引物終濃度為15pmol/juL,雞肉、牛肉、豬肉和馬 肉特異性反向引物終濃度分別為0.015pmol/iaL; Mg2+濃度為1.5mmol/L; dNTP 0.2 mmol/L; 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0); 50 mmol/L KC1; TaqDNA聚合酶2U;用雙蒸水補足體積至30 pL。
4、 一種檢測方法1) 將模板DNA加入權利要求1所述的試劑盒中；2) 在PCR儀上進行目的基因的擴增，PCR條件如下 95'C預變性5min;95 °C 30s,70 °C 10s，60 °C 30s,72 °C 30s, 10個循環； 95。C30s， 60。C30s，72。C30s，25個循環； 72匸延伸7min。3) 將擴增產物進行瓊脂糖凝膠(2.5%)電泳檢測。
5、 根據權利要求4的檢測方法，其中電泳後擴增的特異性條帶分別 為雞肉239bp、牛肉292bp、豬肉412bp、馬肉451bp。
6、 權利要求1或2所述試劑盒在雞肉、牛肉、豬肉和馬肉中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種簡單快速同時檢測雞肉、牛肉、豬肉和馬肉的方法並由此發明了一種檢測試劑盒。首先採用SDS裂解法提取四種肉的DNA模板，並分別針對雞肉、牛肉、豬肉和馬肉設計了特異性的引物，實際擴增片段分別為雞肉239bp、牛肉292bp、豬肉412bp、馬肉451bp。本發明和DNA雜交、酶聯免疫吸附法(ELISA)、色譜法、常規PCR方法、隨機擴增多態性PCR方法(RAPD-PCR)、限制性片斷長度多態性方法(RFLP-PCR)相比更快速、準確、穩定。且較一般的多重PCR方法特異性強，靈敏度高，能夠同時對以上四種肉進行檢測和鑑定。
文檔編號C12Q1/68GK101173316SQ200710175520
公開日2008年5月7日 申請日期2007年9月30日 優先權日2007年9月30日
發明者張方方, 羅雲波, 許文濤, 峰 郭, 黃崑崙 申請人:中國農業大學