一種藍鰭、大目和黃鰭金槍魚生魚片的pcr鑑定方法
2023-05-26 21:44:46
專利名稱：一種藍鰭、大目和黃鰭金槍魚生魚片的pcr鑑定方法
技術領域：
本發明屬於食品檢測技術領域，具體地涉及ー種藍鰭、大目和黃鰭金槍魚生魚片的PCR鑑定方法。
背景技術：
從生物學分類上講，金槍魚指鱸形目(Perciformes)鯖科(Scombridae)金槍魚屬 (Thurmus)的共計8種魚類。經濟價值較大的種類包括藍鰭金槍魚(Thurmus maccoyii), 大臼金槍魚(Thunnus obesus)、黃轄金槍魚(Thunnus albacares)、長轄金槍魚(Thunnus alalunga)等，其中藍鰭金槍魚、大目金槍魚、黃鰭金槍魚是國內生魚片最常見的原料魚。金槍魚肉質柔嫩鮮美，高蛋白低脂肪，含有多種人體必需的胺基酸，還含有微生素、豐富的鐵、鉀、鈣、碘等多種礦物質和微量元素。金槍魚中不飽和脂肪酸DHA(二十ニ碳六烯酸)和EPA (二十碳五烯酸)的含量居各種食物之首。DHA被人們稱之謂腦黃金，是人類大腦和中樞神經系統發育必需的營養素。EPA又稱0MEGA3，是金槍魚所特有的營養物質， 可抑制膽固醇増加和防止動脈硬化，對預防和治療心腦血管疾病有著特殊的作用。鑑於金槍魚的種種優點，目前金槍魚的消費量逐年増大，其中生魚片是金槍魚的最重要的消費方式。藍鰭金槍魚由於捕撈量稀少，因而其經濟價值較高，藍鰭金槍魚是黃鰭金槍魚和大目金槍魚價格的兩倍之多，然而生魚片缺乏外部形態學特徵，不易鑑定其物種來源，不法商家以次充好，以低價值金槍魚生魚片冒充高價值金槍魚生魚片，以獲取暴利，擾亂了市場秩序， 破壞了商業誠信，損害了消費者利益，因此急需針對上述三種金槍魚生魚片建立快速、準確的鑑定方法。生命條形碼技術是物種鑑定常用的ー項技木，該技術利用一段被稱作DNA條形碼 (DNA Barcoding)的序列，通過PCR擴增、測序分析，進行物種鑑定。對於大多數物種而言， 標準的DNA條形碼是細胞色素C氧化酶亞基I基因(COI)的ー個約650bp左右的片段，該片段在種內保守，在種間變異程度大，所以可以用來進行物種鑑另U。但由於金槍魚的分類比較複雜，該技術目前僅能對藍鰭、黃鰭、大目金槍魚生魚片來源魚進行屬(Genus)的鑑定， 不能準確進行種(Species)的鑑別。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供ー種用於藍鰭、大目和黃鰭金槍魚生魚片來源魚品種的PCR鑑定方法，針對目前市場上以黃鰭金槍魚和大目金槍魚生魚片假冒藍鰭金槍魚生魚片的行為，解決金槍魚生魚片來源魚的品種難以鑑別的問題。本發明在DNA條形碼技術的基礎上，通過大量DNA序列數據模擬與實際樣本分析， 確定了上述三種金槍魚COI基因中的種特異性核酸位點，從而為藍鰭、黃鰭、大目三種金槍魚生魚片的鑑別提供了快速準確的技術方法。本發明是通過如下技術方案實現的ー種用於藍鰭、大目和黃鰭金槍魚生魚片來源魚品種的PCR鑑定方法，包括以下步驟1)提取金槍魚生魚片DNA ；2)以提取的DNA為模板，以F1/F2為引物，PCR擴增COI基因片段，其中Fl 5-CACAAAGACATTGGCACCCT-3 ；F2 5-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3 ；3)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段，將650bp的目的條帶切下純化，將純化後的PCR 產物測序；4) PCR產物測序結果通過NCBI網站在線提供的BLSAT軟體，確定金槍魚生魚片來 源魚的屬(Genus)；5)確定屬(Genus)後，再通過分析COI擴增片段的種特異性核酸位點確定金槍魚 生魚片來源魚的品種(Species)，即藍鰭金槍魚的COI基因擴增片段的第337個鹼基為胸腺 嘧啶T，第508個鹼基為鳥嘌呤G，大目金槍魚和黃鰭金槍魚在上述兩個位點均為胞嘧啶C ； 大目金槍魚COI基因擴增片段的第400個鹼基為胞嘧啶C或者鳥嘌呤G，藍鰭金槍魚和黃鰭 金槍魚魚在該位點均為胸腺嘧啶T。進一歩，所述的PCR反應條件為
權利要求
1.一種藍鰭、大目和黃鰭金槍魚生魚片的PCR鑑定方法，其特徵在於包括以下步驟1)提取金槍魚生魚片DNA；2)以提取的DNA為模板，以F1/F2為引物，PCR擴增COI基因片段，其中Fl 5-CACAAAGACATTGGCACCCT-3 ；F2 5-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3 ；3)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段，將650bp的目的條帶切下純化，將純化後的PCR產物測序；4)PCR產物測序結果通過NCBI網站在線提供的BLSAT軟體，確定金槍魚生魚片來源魚的屬(Genus)；5)確定屬(Genus)後，再通過分析COI擴增片段的種特異性核酸位點確定金槍魚生魚片來源魚的品種(Species)，即藍鰭金槍魚的COI基因擴增片段的第337個鹼基為胸腺嘧啶 T，第508個鹼基為鳥嘌呤G，大目金槍魚和黃鰭金槍魚在上述兩個位點均為胞嘧啶C ；大目金槍魚COI基因擴增片段的第400個鹼基為胞嘧啶C或者鳥嘌呤G，藍鰭金槍魚和黃鰭金槍魚魚在該位點均為胸腺嘧啶T。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的PCR反應條件為預、變イ生:950C5.0 mm ,變性940C1.0 mm ^退火500C2.0 mm延伸720C1.5 mm J再延伸720C7.0 min。30個循環，
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述的瓊脂糖凝膠電泳檢測所用的凝膠濃度為0.8%。
全文摘要
一種藍鰭、大目和黃鰭金槍魚生魚片的PCR鑑定方法，屬於食品檢測技術領域，包括以下步驟金槍魚生魚片DNA的提取，以提取DNA為模板，以F1/F2為引物，PCR擴增COI基因片段，電泳檢測擴增片段，純化後將PCR產物測序；PCR測序結果通過NCBI網站在線提供的BLSAT軟體，確定生魚片來源魚的屬；確定屬後，再通過分析COI擴增片段的種特異性核酸位點確定金槍魚生魚片來源魚的品種。本發明從分子水平上對金槍魚生魚片的來源魚品種進行鑑定，能夠準確區分金槍魚生魚片的來源，對規範金槍魚生魚片市場具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102559874SQ201110422249
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月16日 優先權日2011年12月16日
發明者姚琳, 宋春麗, 朱文嘉, 李曉慶, 李燁, 江豔華, 王聯珠, 翟毓秀 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所