一種腫瘤化療藥物敏感性檢測試劑盒的製作方法

2023-05-27 03:14:56 2

一種腫瘤化療藥物敏感性檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種腫瘤化療藥物敏感性檢測試劑盒，包括組織細胞分散酶、抗生素溶液、兩性黴素溶液、EGTA-Trypsin溶液、含血清培養基DF10、無血清培養基Kertin-SFM、標本保存液、標本清洗液、凝膠包被培養瓶、細胞固定液、細胞分散酶、細胞過濾膜、中性紅染色液和膠原凝膠製備試劑；該試劑盒的檢測操作流程包括原代細胞培養、膠原凝膠膠滴內的培養和化療藥物敏感性的分析。與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明試劑盒能最大程度的保護腫瘤細胞活性，縮短藥敏檢測時間，本發明試劑盒包含了腫瘤細胞原代培養與化療藥物檢測所需的所有試劑，耗材都為一次性用品，減少了實驗過程中細菌汙染，使用方便。
【專利說明】一種腫瘤化療藥物敏感性檢測試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發明涉及臨床檢測領域，具體是一種腫瘤化療藥物敏感性檢測試劑盒。

【背景技術】
[0002] 腫瘤化療耐藥是導致化療失敗的主要原因之一，如何制定個體化化療方案提高化 療療效是臨床亟待解決的難題。大量臨床研究表明，腫瘤體外藥物敏感性檢測與臨床療效 存在一定的相關性，體外藥敏檢測能較好的指導臨床用藥，提高臨床療效。
[0003] 目前腫瘤藥物敏感性檢測方法有如下幾種：軟瓊脂克隆形成實驗（HTCA)、四唑藍 比色法（MTT)、差別染色細胞毒檢測方法（DiSC)以及三磷酸腺苷生物發光法。但是這些方 法均有不同程度的不足，限制了他們在臨床的應用，目前臨床上迫切需要切實可行的檢測 方法進行藥敏實驗。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的在於提供一種保留腫瘤細胞活力及生物學活性、實用方便、減少細 菌汙染的腫瘤化療藥物敏感性檢測試劑盒，以解決上述【背景技術】中提出的問題。
[0005] 為實現上述目的，本發明提供如下技術方案： 一種腫瘤化療藥物敏感性檢測試劑盒，包括（1)組織細胞分散酶：膠原酶95?105mg， 溶於4. 5?5.5ml PBS溶液中，過濾除菌，4°C冷藏；（2)2X抗生素溶液：青黴素1.9? 2. lg，硫酸卡那黴素0. 9?1. lg，溶於18?22ml PBS中，過濾除菌，4°C冷藏；（3)兩性黴 素溶液：兩性黴素 B 24?26mg，溶於95?105ml 0. 9%氯化鈉注射液中，過濾除菌，4°C冷 藏；（4)EGTA_Trypsin 溶液：EGTA 36 ?40mg，Trypsin 28 ?32mg，溶於 Hank' s 液中，室溫 靜置lh，過濾除菌，4°C冷藏；（5)含血清培養基DF10 :FBS 45?55ml，2X抗生素溶液，溶 於480?520ml DF培養基中，4°C冷藏；(6)無血清培養基Kertin-SFM，4°C冷藏；（7)標本 保存液：FBS 48?52ml，2X抗生素溶液4. 9?5. lml，兩性黴素溶液4. 8?5. 2ml，溶於 480?520ml DF培養基中，分裝於50ml離心管中，4°C冷藏；（8)標本清洗液：2 X抗生素溶 液4. 9?5. lml，兩性黴素溶液4. 9?5. lml，溶於480?520ml生理鹽水中，常溫保存；（9) 凝膠包被培養瓶：鼠尾膠原凝膠包被的培養瓶常溫保存備用；（10)細胞固定液：1〇%中性 福馬林液；（11)細胞分散酶：〇. 2%胰蛋白酶，4°C冷藏；（12)細胞過濾膜：一次性過濾尼 龍膜250 μ m和300 μ m兩種規格；（13)中性紅染色液：4°C冷藏；（14)膠原凝膠製備試劑： 將鼠尾膠原凝膠溶液、10X 10F12液和緩衝液以8:1:1的比例按順序充分混合均勻，4°C冷 藏備用。
[0006] 一種腫瘤化療藥物敏感性檢測試劑盒的檢測操作流程，具體步驟如下： (1)原代細胞培養：①於手術臺上取得新鮮腫瘤標本，用含有抗生素的生理鹽水衝洗數 遍後置於含有抗生素的保存液中；②超淨臺上用無菌器械將腫瘤標本上的壞死以及血塊等 雜質剔除，再次用含有抗生素的生理鹽水衝洗數遍，置於平皿中；③用無菌剪刀將標本剪碎 至ImmXImmX 1mm，呈米糊狀；④將標本用不含血清的細胞培養液轉移至離心管中，並加入 細胞分散酶，離心管置於35?36°C水浴中消化1?2h ;⑤組織消化呈勻漿狀後，離心機以 1250?1350rpm的轉速離心4?5min ;⑥去除上清，用EGTA-Trypsin液繼續消化2?5min ; ⑦用含血清的細胞培養液終止消化，並用300 μ m尼龍膜過濾；⑧過濾後將分散的細胞再次 以1250?1350rpm的離心轉速4?6min ;⑨去除上清，加入DF10含血清細胞培養液，充分 吹打；⑩將製備好的細胞懸液加入膠原凝膠包被的培養瓶中培養，並置於37°C且含5%C0 2 的培養箱培養24?48h ; (2) 膠原凝膠膠滴內的培養：①顯微鏡觀察腫瘤細胞大量貼壁後，棄去培養瓶中液體， 用0. 2%胰蛋白酶消化瓶內細胞，並輕輕吹打，以除血細胞、死細胞及雜質；②顯微鏡觀察大 量貼壁細胞自瓶壁脫落後用含血清細胞培養液終止胰蛋白酶消化，並衝洗培養瓶數遍，將 含有活細胞的液體回收至離心管中；③離心管用1250?1350rpm的轉速離心4?6min ;④ 去除上清，用微量移液器將細胞吹散，進行細胞計數，調整至最終的細胞濃度為1X 1〇5個/ ml ;⑤於冰上配置膠原混合液，將A液（鼠尾膠原凝膠溶液)、B液（10XF12液)和C液(緩衝 液）以8:1:1的比例按照順序進行充分混勻；⑥用DF10細胞培養液終止消化，並用250 μ m 尼龍膜過濾；⑦將細胞液以1250?1350rpm的轉速離心4?6min，再按照細胞分散液：膠原 混合液=1:10的比例製成含有細胞的膠原混合液；⑧在六孔板上按照每孔3滴，每滴30ul (最終細胞數為3X 103每滴）進行種板；⑨將接種好的六孔板置於37°C，5%C02培養箱中培 養30min待膠原凝固；⑩膠原膠滴凝固後，在每個孔中加入2?4ml含血清的細胞培養液， 培養箱培養23?25h ;在每個孔中加入25?35ul配置好的化療藥物，並設置對照，繼續於 37°C，5%C02培養箱中培養23?25h ;去除六孔板中的細胞培養液，每孔加入4ml不含血清 細胞培養液，震蕩搖勻，置於36?38°C，5%C02培養箱中14?16min，並重複2遍充分洗去 化療藥物；每孔加入4ml Kertin-SFM無血清細胞培養液，於培養箱中培養5?7天； (3) 化療藥物敏感性的分析：①在六孔板的每孔中加入35?45ul中性紅染液，充分搖 勻，置於培養箱中培養1?2h ;②去除孔中液體，每孔加入3?5ml PBS液，室溫震蕩後去 除PBS ;③每孔加入10%中性福馬林液，室溫靜置40?50min ;④移除10%中性福馬林 液，將培養板置於清水中8?12min ;⑤室溫風乾後用Image Pro Plus軟體對每個膠原凝 膠膠滴進行染色比色分析，並通過細胞形態學以及著色程度的差異區別腫瘤細胞以及非腫 瘤細胞。
[0007] 與現有技術相比，本發明的有益效果是： 1、試劑盒能最大程度的保護腫瘤細胞活性及腫瘤細胞生物學特性，縮短藥敏檢測時 間。
[0008] 2、試劑盒包含了腫瘤細胞原代培養與化療藥物檢測所需的所有試劑，耗材都為一 次性用品，減少了實驗過程中細菌汙染，使用方便。

【具體實施方式】
[0009] 下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的 實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬於本發明保護的範圍。
[0010] 本發明實施例中，一種腫瘤化療藥物敏感性檢測試劑盒，包括 (1) 組織細胞分散酶：膠原酶95?105mg，溶於4. 5?5. 5ml PBS溶液中，過濾除菌， 4°C冷藏，特殊的組織酶配方能快速的分散癌細胞團快，並最大限度的減少酶消化過程中對 細胞的毒性； (2) 2X抗生素溶液：青黴素1. 9?2. lg，硫酸卡那黴素0. 9?1. lg，溶於18?22ml PBS中，過濾除菌，4°C冷藏； (3) 兩性黴素溶液：兩性黴素 B 24?26mg，溶於95?105ml 0. 9%氯化鈉注射液中， 過濾除菌，4°C冷藏； (4) EGTA_Trypsin 溶液：EGTA 36 ?40mg，Trypsin 28 ?32mg，溶於 Hank's 液中，室溫 靜置lh，過濾除菌，4°C冷藏； (5) 含血清培養基DF10 :FBS 45?55ml，2 X抗生素溶液，溶於480?520ml DF培養 基中，4°C冷藏，腫瘤細胞專用培養基，能促進腫瘤細胞生長，保持良好細胞活力； (6) 無血清培養基Kertin-SFM，4°C冷藏，無血清培養基能保證腫瘤細胞的良好增殖， 同時抑制成纖維細胞增殖； (7) 標本保存液：FBS 48?52ml，2 X抗生素溶液4. 9?5. lml，兩性黴素溶液4. 8? 5. 2ml，溶於480?520ml DF培養基中，分裝於50ml離心管中，4°C冷藏； (8) 標本清洗液：2 X抗生素溶液4. 9?5. lml，兩性黴素溶液4. 9?5. lml，溶於480? 520ml生理鹽水中，常溫保存； (9) 凝膠包被培養瓶：鼠尾膠原凝膠包被的培養瓶常溫保存備用，凝膠包被培養瓶培 養能促進腫瘤細胞貼壁，去除血細胞、死細胞及雜質細胞幹擾； (10) 細胞固定液：1〇%中性福馬林液，將膠滴中的細胞進行固定； (11) 細胞分散酶：〇. 2%胰蛋白酶，4°C冷藏，能快速、有效的消化貼壁的細胞； (12) 細胞過濾膜：一次性過濾尼龍膜250 μ m和300 μ m兩種規格，能有效除去未消化 的組織塊； (13) 中性紅染色液：4°C冷藏，利用三維培養的腫瘤細胞與正常細胞的中性紅染色特點 不同，便於在定量時排除成纖維細胞的幹擾； (14) 膠原凝膠製備試劑：將鼠尾膠原凝膠溶液、10X 10F12液和緩衝液以8:1:1的比例 按順序充分混合均勻，4°C冷藏備用，膠原凝膠作為細胞外基質，能模擬癌細胞在體內的生 長環境，癌細胞在膠原凝膠中立體生長，呈現與體內相似的增殖形態與功能特質。
[0011] 一種腫瘤化療藥物敏感性檢測試劑盒的檢測操作流程，具體步驟如下： (1) 原代細胞培養：①於手術臺上取得新鮮腫瘤標本，用含有抗生素的生理鹽水衝洗 數遍後置於含有抗生素的保存液中；②超淨臺上用無菌器械將腫瘤標本上的壞死以及血塊 等雜質剔除，再次用含有抗生素的生理鹽水衝洗數遍，置於平皿中；③用無菌剪刀將標本剪 碎至ImmXImmX 1mm，呈米糊狀；④將標本用不含血清的細胞培養液轉移至離心管中，並加 入細胞分散酶，離心管置於35°C水浴中消化2h ;⑤組織消化呈勻漿狀後，離心機以1300rpm 的轉速離心5min ;⑥去除上清，用EGTA-Trypsin液繼續消化4min ;⑦用含血清的細胞培養 液終止消化，並用300 μ m尼龍膜過濾；⑧過濾後將分散的細胞再次以1300rpm的離心轉速 5min ;⑨去除上清，加入DF10含血清細胞培養液，充分吹打；⑩將製備好的細胞懸液加入膠 原凝膠包被的培養瓶中培養，並置於37°C且含5%C0 2的培養箱培養36h ; (2) 膠原凝膠膠滴內的培養：①顯微鏡觀察腫瘤細胞大量貼壁後，棄去培養瓶中液體，
【權利要求】
1. 一種腫瘤化療藥物敏感性檢測試劑盒，其特徵在於，包括（1)組織細胞分散酶：膠原 酶95?105mg，溶於4. 5?5. 5ml PBS溶液中，過濾除菌，4°C冷藏；（2) 2 X抗生素溶液：青 黴素1. 9?2. lg，硫酸卡那黴素0. 9?1. lg，溶於18?22ml PBS中，過濾除菌，4°C冷藏； (3)兩性黴素溶液：兩性黴素 B 24?26mg，溶於95?105ml 0. 9 %氯化鈉注射液中，過濾除 菌，4°C冷藏；（4) EGTA-Trypsin 溶液：EGTA 36 ?40mg，Trypsin 28 ?32mg，溶於 Hank's 液 中，室溫靜置lh，過濾除菌，4°C冷藏；（5)含血清培養基DF10 :FBS 45?55ml，2X抗生素溶 液，溶於480?520ml DF培養基中，4°C冷藏；（6)無血清培養基Kertin-SFM，4°C冷藏；（7) 標本保存液：FBS 48?52ml，2 X抗生素溶液4. 9?5. lml，兩性黴素溶液4. 8?5. 2ml，溶 於480?520ml DF培養基中，分裝於50ml離心管中，4°C冷藏；（8)標本清洗液：2 X抗生素 溶液4. 9?5. lml，兩性黴素溶液4. 9?5. lml，溶於480?520ml生理鹽水中，常溫保存； (9)凝膠包被培養瓶：鼠尾膠原凝膠包被的培養瓶常溫保存備用；（10)細胞固定液：10%中 性福馬林液；（11)細胞分散酶：〇. 2%胰蛋白酶，4°C冷藏；（12)細胞過濾膜：一次性過濾 尼龍膜250 μ m和300 μ m兩種規格；（13)中性紅染色液：4°C冷藏；（14)膠原凝膠製備試 齊U :將鼠尾膠原凝膠溶液、l〇X 10F12液和緩衝液以8:1:1的比例按順序充分混合均勻，4°C 冷藏備用。
2. -種腫瘤化療藥物敏感性檢測試劑盒的檢測操作流程，其特徵在於，具體步驟如 下： (1) 原代細胞培養：①於手術臺上取得新鮮腫瘤標本，用含有抗生素的生理鹽水衝洗數 遍後置於含有抗生素的保存液中；②超淨臺上用無菌器械將腫瘤標本上的壞死以及血塊等 雜質剔除，再次用含有抗生素的生理鹽水衝洗數遍，置於平皿中；③用無菌剪刀將標本剪碎 至ImmXImmX 1mm，呈米糊狀；④將標本用不含血清的細胞培養液轉移至離心管中，並加入 細胞分散酶，離心管置於35?36°C水浴中消化1?2h ;⑤組織消化呈勻漿狀後，離心機以 1250?1350rpm的轉速離心4?5min ;⑥去除上清，用EGTA-Trypsin液繼續消化2?5min ; ⑦用含血清的細胞培養液終止消化，並用300 μ m尼龍膜過濾；⑧過濾後將分散的細胞再次 以1250?1350rpm的離心轉速4?6min ;⑨去除上清，加入DF10含血清細胞培養液，充分 吹打；⑩將製備好的細胞懸液加入膠原凝膠包被的培養瓶中培養，並置於37°C且含5%C0 2 的培養箱培養24?48h ; (2) 膠原凝膠膠滴內的培養：①顯微鏡觀察腫瘤細胞大量貼壁後，棄去培養瓶中液體， 用0. 2%胰蛋白酶消化瓶內細胞，並輕輕吹打，以除血細胞、死細胞及雜質；②顯微鏡觀察大 量貼壁細胞自瓶壁脫落後用含血清細胞培養液終止胰蛋白酶消化，並衝洗培養瓶數遍，將 含有活細胞的液體回收至離心管中；③離心管用1250?1350rpm的轉速離心4?6min ;④ 去除上清，用微量移液器將細胞吹散，進行細胞計數，調整至最終的細胞濃度為1X 1〇5個/ ml ;⑤於冰上配置膠原混合液，將A液（鼠尾膠原凝膠溶液)、B液（10XF12液)和C液(緩衝 液）以8:1:1的比例按照順序進行充分混勻；⑥用DF10細胞培養液終止消化，並用250 μ m 尼龍膜過濾；⑦將細胞液以1250?1350rpm的轉速離心4?6min，再按照細胞分散液：膠原 混合液=1:10的比例製成含有細胞的膠原混合液；⑧在六孔板上按照每孔3滴，每滴30ul (最終細胞數為3 X 103每滴)進行種板；⑨將接種好的六孔板置於37°C，5%C02培養箱中培養 30min待膠原凝固；⑩膠原膠滴凝固後，在每個孔中加入2?4ml含血清的細胞培養液，培 養箱培養23?25h ;在每個孔中加入25?35ul配置好的化療藥物，並設置對照，繼續於 37°C，5%C02培養箱中培養23?25h ;去除六孔板中的細胞培養液，每孔加入4ml不含血 清細胞培養液，震蕩搖勻，置於36?38°C，5%C02培養箱中14?16min，並重複2遍充分洗 去化療藥物；每孔加入4ml Kertin-SFM無血清細胞培養液，於培養箱中培養5?7天； (3)化療藥物敏感性的分析：①在六孔板的每孔中加入35?45ul中性紅染液，充分搖 勻，置於培養箱中培養1?2h ;②去除孔中液體，每孔加入3?5ml PBS液，室溫震蕩後去 除PBS ;③每孔加入10%中性福馬林液，室溫靜置40?50min ;④移除10%中性福馬林 液，將培養板置於清水中8?12min ;⑤室溫風乾後用Image Pro Plus軟體對每個膠原凝 膠膠滴進行染色比色分析，並通過細胞形態學以及著色程度的差異區別腫瘤細胞以及非腫 瘤細胞。
【文檔編號】G01N21/78GK104111254SQ201410323075
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月9日 優先權日:2014年7月9日
【發明者】李維 申請人:李維