鴨源性冠狀病毒夾心elisa試劑盒及其應用的製作方法
2023-05-27 17:55:46 1
專利名稱：鴨源性冠狀病毒夾心elisa試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及病毒檢測技術，具體涉及一種鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒及其應用。
背景技術：
河南省鄭州某養殖場2004年5月發生了以腹瀉和生長遲緩為主要症狀的疑似IB 疾病，感染雞主要表現精神沉鬱，下痢，生長緩慢及抵抗力下降，發病率為100%，死亡率達 10%以上，感染雞群的生產性能顯著降低。調查中顯示，與雞舍相距僅150米左右處有一個1700隻的肉鴨群，在第一批雞發病前約10天左右鴨群發生過類似症狀的疾病。死亡雞病變主要為小腸出血，腸壁變薄，有的有潰蕩，小腸絨毛脫落，腺胃乳頭腫大、黏膜脫落，有的肌胃和腺胃交界處有出血，肌胃有出血或潰蕩，腎臟腫大，呈「花斑腎」，肺臟無明顯變化， 法氏囊、胸腺等免疫器官萎縮；病鴨剖檢以腎臟腫大，蒼白兼有出血、腿肌及肝臟出血為主要特徵。在同地區的其他雞場也發生了同樣症狀的疾病，雖然經過多種IBV疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技學院動物科學學院開展了對該疫病的研究工作，結果從發病鴨體內分離到一株病毒，鑑定為IBV，命名為鴨源性冠狀病毒ZZ2004株(保藏編號CGMCC NO. 3842)，其專利文獻公開號為CN 101906404A，此為首次有關家鴨感染IBV的報導。本病毒分離株ZZ2004來自雞鴨混養的養殖場，其不僅引起雞的大批發病及死亡，還感染了鴨群，嚴重影響了家鴨的生長發育並導致鴨的死亡。與其它禽類的冠狀病毒相比，鴨源性冠狀病毒ZZ2004變異的程度較大，對動物的感染譜更廣。目前，國內外已建立了許多IBV相關的診斷技術，主要分為抗體檢測和抗原檢測兩大類。抗體檢測方法包括間接免疫螢光法、ELISA法、免疫過氧化物酶單層細胞試驗、中和試驗等。目前所有針對抗體的檢測方法都無法區分免疫雞群和感染雞群，從而影響疫病的及時、有效防控。而抗原檢測方法則結果較直接，能明確病毒感染。針對IBV抗原檢測的方法主要有RT-PCR法、病毒分離、免疫組化等，各方法均存在一些不足之處。例如，病毒分離方法耗時、費力；免疫組化方法操作繁瑣，影響因素較多，並且結果判斷具有一定的主觀性； RT-PCR方法對檢測人員實驗操作技能要求較嚴格，且成本較高。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種特異性強、精確度高、操作簡便、檢測快速的鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒，並公開了其應用方法。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是
一種鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒，包括洗滌液、封閉液、底物顯色液、終止液，其還包括
(1)包被抗體的酶標板以抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的單抗作為包被抗體，用包被液將單抗稀釋到lOPg/ml，每孔加入ΙΟΟμ ，4°C冰箱中過夜，用洗滌液PBST洗滌2 4次，再向酶標板中加入5% (g/mL)的BSA封閉液，ΙΟΟμ ν孔，37°C反應2h，洗滌液PBST洗滌2 4次；
(2)捕獲抗體兔抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的多抗；
(3)酶標抗體HRP標記的羊抗兔IgG。所述抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的單抗由保藏編號為CGMCC NO. 4171的雜交瘤細胞株3H10分泌製得。所述兔抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的多抗的製備方法如下
將病毒進行純化，選擇2. 0 2. 5 kg之間的大白兔進行四次免疫，時間分別為第1天， 第14天，第28天和第30天，第4次免疫後一周進行心臟採血，分離血清，即得兔抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的多抗。所述鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒的應用方法，包括以下步驟
(1)加待檢樣品取試劑盒中的包被抗體的酶標板，向其中加入經過處理的待檢樣品， ΙΟΟμ ν孔，同時分別設立陽性對照和陰性對照，37°C下反應25 35min，洗滌液PBST洗滌 2 4次；
(2)添加捕獲抗體取試劑盒中的捕獲抗體，按1:100倍稀釋後加入到上述酶標板中， ΙΟΟμ ν孔，37°C反應25 35min，洗滌液PBST洗滌2 4次；
(3)添加酶標抗體取試劑盒中的酶標抗體，用洗滌液PBST按照1:1000的比例進行稀釋並混勻，ΙΟΟμ ν孔，37°C下反應25 35min，以洗滌液PBST洗滌2 4次；
(4)顯色加入TMB顯色液，ΙΟΟμ ν孔，在室溫下顯色8 12min，用2M的H2SO4為終止液終止顯色；
(5)測OD值用酶標儀進行測量，測OD值。所述待檢樣品的前處理方法如下
採集相應的待檢組織器官1. 0g，進行研磨，加入Iml滅菌的PBS緩衝液，IOOOrpm離心 IOmin,取上清，8000rpm離心lOmin，取上清。在所述步驟(5 )中，當P/N值> 2時，待檢樣品為陽性，其中P為待檢樣品的OD值， N為陰性對照的OD值。本發明具有積極有益的效果
1.本發明中所用的包被抗體為單克隆抗體，有力地排除了多種非特異性的幹擾，特異性強，精確度高；
2.本發明僅涉及的簡單的檢測儀器，操作步驟簡便，普通技術人員也易於操作使用，易於推廣普及；
3.本發明適用於大量樣品的檢測，快速便捷，且檢測成本低。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步闡述本發明。下述實施例中的試驗方法，如無特別說明，均為常 規方法。下述實施例中所用的試驗材料及試劑，如無特別說明，均購自常規生化試齊Ll商店。實施例1 一種鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒，包括洗滌液、封閉液、底物顯色液、終止液，以及
(1)包被抗體的酶標板用抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的單抗作為包被抗體，用包被液將單抗稀釋到lOPg/ml，每孔加入10(^L，4°C冰箱中過夜，用洗滌液PBST洗滌3次；向酶標板中加入5%的BSA封閉液，ΙΟΟμΙ/孔，37°C反應2h，洗滌液PBST洗滌3次；
上述抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的單抗由保藏編號為CGMCC NO. 4171的雜交瘤細胞株3H10分泌製得，詳細製備方法可參見發明人的另一項專利文獻CN 101993856A。(2)捕獲抗體兔抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的多抗；其製備方法為將病毒進行純化，選擇2. 0 2. 5 kg之間的日本大白兔進行免疫，免疫分四次，時間分別為第1天，第14 天，第28天和第30天，第4次免疫後一周進行心臟採血，分離血清，即為兔抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的多抗。(3)酶標抗體HRP標記的羊抗兔IgG (購於寶賽生物公司)； 以上述鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒應用方法如下
(1)加待檢樣品分別採集人工感染鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的雞的心臟、肝臟和腎臟組織1. 0g，進行研磨，加入Iml滅菌的PBS緩衝液，IOOOrpm離心lOmin，取上清，8000rpm 離心lOmin，取上清；取試劑盒中的包被抗體的酶標板，向其中加入上步所得上清，每孔中加入100μ ，同時分別設立陽性對照和陰性對照，37°C反應30min，洗滌液PBST洗滌3次。(4)添加捕獲抗體用兔抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的多抗作為捕獲抗體，1 100 倍稀釋，ΙΟΟμ /孔，37°C下反應30min，洗滌液PBST洗滌3次。(5)添加酶標抗體取HRP標記的羊抗兔IgG，用PBST按照1:1000的比例進行稀釋並混勻，ΙΟΟμ /孔，37°C下反應30min，洗滌液PBST洗滌3次。(6)顯色每孔中加入TMB顯色液100μ1，在室溫下顯色10分鐘，用2Μ的H2SO4終止顯色。(7)測OD值用酶標儀進行測量，測OD值，測得各樣品及陽性對照、陰性對照的OD 值如表1所示。其陽性判定標準為Ρ/Ν大於2即為陽性(其中P為待檢樣品的OD值，N為陰性對照的OD值)，從表1中可知，人工感染的雞的心臟、肝臟和腎臟中均含有鴨源性冠狀病毒 ΖΖ2004 株。表1各待檢樣品及陽性對照、陰性對照酶標儀測量的OD值_
權利要求
1.一種鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒，包括洗滌液、封閉液、底物顯色液、終止液， 其特徵在於，它還包括(1)包被抗體的酶標板以抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的單抗作為包被抗體，用包被液將單抗稀釋到lOPg/ml，每孔加入ΙΟΟμ ，4°C冰箱中過夜，用洗滌液PBST洗滌2 4次，再向酶標板中加入5%的BSA封閉液，ΙΟΟμ ν孔，37°C下反應2h，洗滌液PBST洗滌2 4次；(2)捕獲抗體兔抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的多抗；(3)酶標抗體HRP標記的羊抗兔IgG。
2.根據權利要求1所述的鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒，其特徵在於，所述抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的單抗由保藏編號為CGMCC NO. 4171的雜交瘤細胞株3H10分泌製得。
3.根據權利要求1所述的鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒，其特徵在於，所述兔抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的多抗的製備方法如下將病毒進行純化，選擇2. O 2. 5 kg之間的大白兔進行四次免疫，時間分別為第1天， 第14天，第28天和第30天，第4次免疫後一周進行心臟採血，分離血清，即得兔抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的多抗。
4.權利要求1所述的鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒的應用方法，包括以下步驟(1)加待檢樣品取試劑盒中的包被抗體的酶標板，向其中加入經過處理的待檢樣品， ΙΟΟμ ν孔，同時分別設立陽性對照和陰性對照，37°C下反應25 35min，洗滌液PBST洗滌 2 4次；(2)添加捕獲抗體取試劑盒中的捕獲抗體，按1:100的體積比稀釋後加入到上述酶標板中， οομ ν孔，37°C下反應25 35min，洗滌液PBST洗滌2 4次；(3)添加酶標抗體取試劑盒中的酶標抗體，用洗滌液PBST按照1:1000的比例進行稀釋並混勻，ΙΟΟμ ν孔，37°C下反應25 35min，以洗滌液PBST洗滌2 4次；(4)顯色加入TMB顯色液，ΙΟΟμ ν孔，在室溫下顯色8 12min，用2M的H2SO4為終止液終止顯色；(5)測OD值用酶標儀進行測量，測OD值。
5.根據權利要求4所述的鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒的應用方法，其特徵在於， 所述待檢樣品的前處理方法如下採集相應的待檢組織器官1. 0g，進行研磨，加入Iml滅菌的PBS緩衝液，IOOOrpm離心 IOmin,取上清，8000rpm離心lOmin，取上清。
6.根據權利要求5所述的鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒的應用方法，其特徵在於， 在所述步驟(5)中，當P/N值>2時，待檢樣品為陽性，其中P為待檢樣品的OD值，N為陰性對照的OD值。
全文摘要
本發明涉及一種鴨源性冠狀病毒夾心ELISA試劑盒及其應用。該試劑盒包括洗滌液、封閉液、底物顯色液、終止液、包被抗鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的單抗的酶標板、捕獲抗體及酶標抗體；其檢測方法為將待檢樣品放入包被抗體的酶標板，再依次添加捕獲抗體、酶標抗體反應後加顯色劑顯色，測OD值。本發明中所用的包被抗體為單克隆抗體，有力地排除了多種非特異性的幹擾，特異性強，精確度高；本發明僅涉及的簡單的檢測儀器，操作步驟簡便，普通技術人員也易於操作使用，易於推廣普及；本發明適用於大量樣品的檢測，快速便捷，且檢測成本低。
文檔編號G01N33/577GK102221611SQ20111010351
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月25日 優先權日2011年4月25日
發明者劉興友, 劉明成, 王麗榮, 胡建和 申請人:河南科技學院