奶牛產奶量相關基因socs-2作為輔助選擇標記上的應用的製作方法

2023-05-27 06:44:56 1

專利名稱：：奶牛產奶量相關基因socs-2作為輔助選擇標記上的應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於家畜分子標記製備
技術領域：
，具體涉及一種奶牛產奶性狀相關基因2基閃的擴增，選擇其突變位點作為奶牛遺傳標記(分子標記)及其在奶牛標記輔助選擇上的應用。
背景技術：
：我國牛奶和牛肉的生產同發達國家相比差距較大，主要是因為我國奶牛品種和遺傳品質比較差。應用分子標記的現代育種技術對於提高奶牛的產奶量和改善乳品質是先進有效的方法。將靈敏度極高的一些DNA分析手段應用於奶牛育種中，其主要目的是在DNA分子水平上尋找與奶牛產奶性狀密切相關的遺傳標記，用於奶牛的標記輔助選擇(MarkerAssistedSelection,MAS)，實現早期選擇，加快育種速度.細胞因子信號抑制因子CS"(^》家族是一類對細胞因子信號通路具有負反饋調節作用的蛋白分子，參與多種細胞因子、生長因子和激素的信號調節。S0CS-2是S0CS家族中的一員，在機體的生長發育中起重要調節作用。S0CS2-/-小鼠出生後至3周內都看似正常，但它們的體重比野生型對照組小鼠大30%~40%，其體重的增加不是因為脂肪過多，而是因為內臟器官、肌肉重量增加，骨骼和身體長度增加。雄性S0CS2-/-小鼠還表現為膠原沉積及心臟、肺臟及脾臟IGF-lmRNA水平升高(MetcalfD，GreenhalghCJ,VineyE.Gigantisminmicelackingsu卯ressorofcytokinesignaling-2.Nature,2000，405(6790):1069-1073)。因為S0CS2-/-小鼠體積異常增大，且其表型與GH及IGF-l轉基因小鼠表型相似，因此S0CS-2可能是生長促進因子(growth-promotingcytokines)如ffi7及/fi^-7的負調節因子，S0CS2—小鼠的異常表徵可能與W和7KF-7的信號蛋白過度表達有關。在肝臟等組織中存在品信號傳導增強的證據，提示5rT5-2可能通過調節G禍卩/6^-/的信號傳導而在生長的調節中發揮重要生理作用。體外實驗發現，S075"^在低濃度時可抑制ffl的作用，而高濃度時則可增強其信號轉導。Greenhalgh等(GreenhalghCJ,MetcalfD，ThausAJ.BiologicalevidencethatSOCS-2canacteitherasanenhancerorsuppressorofgrowthhormonesignaling.JBiolChem,2002,277(43):4018卜40184)新近發現，■WCS-效表達的小鼠並未出現生長缺陷，實際上，其體積明顯大於野生型小鼠。因此，S^S-2對^#信號轉導可能有雙重作用。而生長激素(6^)是調節動物生長和發育的重要激素之一，ZW可促進卵泡生長，加快卵母細胞成熟，協助排卵，加快初情期與性成熟，促進生殖器官的生長與發育，刺激胎盤生長，促進胚胎的生長與分化，還對生殖激素有調節作用(方富貴'章孝榮.生長激素與生殖.黑龍江動物繁殖'2008,16(1):4-5)。生長激素在畜禽生產上的應甩已有很多報導，如(高雪，徐秀容，許尚忠，張英漢.影響牛生長發育性狀的GH基因遺傳效應分析.中國農業科學.2006'39(3):606-611)GH基因的第5外顯子、33'非翻譯區的基因型效應在肉牛體重、體高、體斜長、胸圍和肉用指數性狀上存在顯著差異(P0.05),BB基因型個體的產奶量最高，而AB基因型的個體最低。有表2可知^7cs-i^及w了I不同的基因型對乳脂率和乳蛋白率的影響沒有顯著的差異(P>0.05)。由表3中可以得出2種基因型間對奶牛產奶量的影響有達到顯著差異(P0.05)。序列表SEQIDNO:1S是本發明克隆的5"OT5-2基因的部分核苷酸序列。圖1:是本發明的技術流程圖圖2，6:是本發明擴增的6VK5"-i"基因的部分DNA片段。圖3和7:是用於PCR產物直接測序的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖。瓊脂糖膠濃度為1.2%。圖3中l一5泳道為PCK產物，長度為158bp;M泳道DNA分子量標記(100bpDNAladder);圖7中1-3泳道4是PCR產物，M泳道是DNA分子量標記(lOObpDNAladder)圖4和8:PCK產物測序的彩峰圖，黑色背景處即為多態位點。圖5和9:是奶牛S60"-^基因序列的C5265-A5265和T5306-G5306多態性的檢測結果。具體實施例方式實施例1牛S0CS-2基因部分DNA序列的擴增及其多態性檢測1、奶牛S0CS—2基因部分DNA序列的擴增1.1引物設計根據Ensembl(http:〃ww.ensembl.org/)提供的牛，510.2uL(10U/uL)，10X緩衝液liiL，PCR產物2uL,加ddlI20至IOpL，55'C條件下水浴酶切34小時。W4-2引物的酶切體系相同，限制性內切酶為歷'/2/I。3.3PCR-RFLP檢測酶切產物檢測由於本試驗擴增產物片斷較小，所以都用聚丙烯醯胺凝膠進行酶切結果檢測，所用的丙烯醯胺膠聯度為29:1濃度為8%的凝膠。每板膠35mL，配製方法30%丙烯醯胺9.3mL雙蒸水18.42mL5XTBE:14mL10%AP:0.23mLTEMED:20uL酶切產物用8%丙烯醯胺凝襲電泳'緩衝液為1XTBE，U0V恆壓4小時，用銀染法染色'拍照，並由帶型7來判斷基因型，記錄基因型。實施例2:牛S0CS-2基因變異對產奶性狀的遺傳效應分析多態位點基閔型和基因頻率的初步分析結果顯示，在271頭奶牛中，其中BB基因型在該研究群體中的頻率最大，為0.6347、其次是AB基因型，為0.3026、而M基因型最低，為0.0627。等位基因A的頻率為0.214，等位基因B的頻率為0.786。由此可以看出B為優勢等位基因。w"-多&'//1多態位點基因型和基因頻率的初步分析結果顯示，在260頭奶牛中，其中BB基因型在該研究群體中的頻率最大，為0.75、其次是AB基因型，為0.25。等位基因A的頻率為0.125，等位基因B的頻率為0.875。由此可以看出B為優勢等位基因。由表1中可以得出三種基因型間對奶牛產奶量的影響沒有達到顯著差異(P>0.05)，BB基因型個體的產奶量最高，而AB基因型的個體最低。由表2可知socs-^^w了I不同的基因型對乳脂率和乳蛋白率的影響沒有顯著的差異(P>0.05)。由表3中可以得出2種基因型間對奶牛產奶量的影響有達到顯著差異(P0.05)。表lSOM-Z基因&TJ了I酶切多態性與產奶量的統計分析基因型樣本數產奶量GenotypeNumberMilkyieldAA.176113.52±1487.17AB826004.86±1414.45BB1726159.30±1282.70注具有相同字母表示差異不顯著(P>0.05),字母不同表示差異顯著(P<0.05)。表2socs-2-BsiYI酶切多態性與乳脂率和乳蛋白率的統計分析tableseeoriginaldocumentpage8注具有相同字母表示差異不顯著(P>0.05),字母不同表示差異顯著(&0.01)。表3socs-2基因HinfI酶切多態性與產奶量的統計分析基因型樣本數.產奶量Genotype,NumberMilkyieldAB655822.44±1309.91aBB1956229.05±1207.13b注具有相同字母表示差異不顯著(P>0.05),字母不同表示差異顯著(P0.05),字母不同表示差異顯著(P<0.01)。9序列表華中農業大學奶牛產奶量相關基因SOCS-2作為辨助選擇標記上的應角2009-03-17'1Patentlnversion3.116080薩奶牛(Bovineadenovirustype1)g6H6(l)..(6080)<120〉<212〉〈222〉〈220>〈221〉<220〉<221〉<222〉<400〉1accctcggcggcgggcttagcctgcacggcttggagacagtctcttgcgcgtctcggagcgcatccgccccgaccgggtagcaactgcgccggagtctctcctggaaagttcctggaaaggacgcgg卿gaggcgggg3ccgctcccgggacggacgttmutation(5306)..(5306)mutation(5265)..(5265)gggcgagcatgtctgttcatgcitcccgccgcgggaaccgg3caccc3ggcgttgggggtcgaaacccgagcgctcggagctt肌3gcagt3gCgggggCCcggcctccgcagccgctggg'gtg3ggg3ggCgCgt3CgtCtaaactctagtctcgccgcccgctcgaccccggcgcactg60ctcggtggtggcctggggct120agaggagggcsgsttcccsg180ccgtctctcccgaagcctgc240gCggtC3Cgtg3ggtgg3tt300cggggcgcgcggggagcgcg360tggga肌tcgcgcgc8C3C3420gccgccgcggctcgcgggcc480ctgggcttcccctgaagcstgagcctcctcgcccgccgccactggcggtt卿ggggcca540Cgg3CggCgCgcgccggggccccgggtgcccttgacaacaggatcgccttcgcctgcagc600tggggcgcca肌ggagctcgggccggcggccccgggagcccgaaggctcc660gcccccacgagggCtgggg3gggcactggggcgcggccgccagcgccaggcagcctgggc720ttccgcagtttggsgccgccgggcttg卿gtcgg咖tgtggctctgcc'cgggggctgg780gagctactgcctgctttctccggttctttcccggcgtctgggagtctcceigagttttttt840ttttttcctccccccgcccct^t犯actgccatccagattaataatccttctaataacct900gatctcccgctcctccccacccgcctgcctcccgccctgactctttcctccctccctctc960cccttctcatctccttggctgC3gCCgg3gggaeicccagcagctgccccgggtcgggggg1020cgggggctgtcggagcccggaggaggtgtcagcccagccagtcgaggceigtggtccctgg1080g3CtC3Cgtttactctctgcgcagsgaactccggscgtctccgccgctgagcgcagggct1140agtcaccgccttgggcatctcgttcccaaattaaa3agtc1200accgctcctcccgggcccctcccggctcccccgcccagtgcgggctggagtctgcctggt1260gtggaggcggCC3CggCgttcg鄉ccgaggt朋gggctcggcgttggttgtctagcatg1320tcccacggagctctcagcctcgtgctcggcctgggctcgggtcacgggtcggagcccccg1380cg鄉tctgcgcgctcgggcagattcctcg8C3gCgCCCgcggcggcagcagcagcagca1440gcaggagccgcccgacctcgg，cggcagcctcggcggcCCCCC3￡ICCCgtgccctcag1500cgggggc鄉agcctcttctgcggggtggccgcagctcccgcacctctga1560gtcccggactgccggctctgcccggggagccccgcggcgctctagggtcggt犯cteggt1620ttgtgccgggggcttcttccggggctcctcgggctgtgcsgagtgtg卿卿g敏gcc1680aatttggggaccttgcctgtttccttttcaaatttctgcttgcccatttaccaccgtgcc1740cacaggtgactcttcgctct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技術領域：
。具體公開了一種作為分子標記的與奶牛產奶性狀相關的SOCS-2基因，它的核苷酸序列的序列如序列表SEQIDNO1所示，在序列表SEQIDNO1第5265bp處有一個C5265-A5265的鹼基突變，導致BsiYI-RFLP多態性；在序列表SEQIDNO1第5306bp處有一個T5306-G5306的鹼基突變，導致HinfI-RFLP多態性。以上述SOCS-2基因對奶牛的一些性狀進行了關聯分析。文檔編號C12P19/00GK101503689SQ20091006115公開日2009年8月12日申請日期2009年3月18日優先權日2009年3月18日發明者何年華,張淑君,楊利國,熊家軍,成王,秦春娥,胡修忠,錢運國,陳世林,高長明申請人:華中農業大學