腫瘤抑制劑mln4924在製備抗病毒藥物中的應用的製作方法
2023-06-17 02:49:01 2
腫瘤抑制劑mln4924在製備抗病毒藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了腫瘤抑制劑MLN4924在製備抗病毒藥物中的應用。通過實驗證明在抗腫瘤臨床人體試驗中有較好表現的小分子抑制劑MLN4924具有較強的抗病毒活性，通過抑制病毒輔助蛋白作用，能夠達到大於80%的抑制病毒複製。由於該藥物具有較長的前期實驗性臨床應用經驗，藥物作用效果強，可大規模生產，因而具有很大的潛力成為高效抗病毒藥物。利用小分子藥物抑制病毒蛋白主導的Neddylation激活下的泛素系統，檢測腫瘤抑制劑MLN4924在製備抗病毒藥物中的應用價值。
【專利說明】腫瘤抑制劑MLN4924在製備抗病毒藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種腫瘤抑制劑MLN4924的新用途。
【背景技術】
[0002]病毒作為危害人類健康的重要病原體，已成為全球性的公共衛生領域的難題，至今人們仍然沒有找到非常有效的治療藥物和方法。不同病毒的傳播以及在宿主體內的複製方式也存在著較大的差異。隨著近二十年病毒與宿主間相互作用的研究，已經發現了一系列的天然抗病毒因子，諸如AP0BEC3G，BST-2, Trim5_a以及SAMHDl等。然而病毒不斷的複製過程中也形成了各異的適應機制來逃避宿主免疫防禦。其中，病毒利用所編碼的病毒蛋白通過篡奪宿主泛素化系統來促進抗病毒因子的蛋白酶體依賴性降解是最為普遍的策略。
[0003]Cullin家族蛋白作為重要的泛素系統連接蛋白，直接參與泛素化過程的調控。前期國際多項研究揭示Cullin家族蛋白廣泛涉及生物體發育、細胞周期調控、DNA損傷修復以及腫瘤發生等過程。然而，Cullin蛋白組成的泛素E3複合體也被許多病毒蛋白所劫持，特異性的促進宿主蛋白降解進而促進病毒複製與傳播。病毒蛋白識別泛素E3複合體的現象普遍存在於DNA病毒和RNA病毒中，成為國際公認的新型抗病毒疫苗與藥物研究靶點(表I)。
[0004]小分子抑制劑MLN4924能夠特異性的結合Nedd8活化酶(NAE)，破壞Nedd8分子的正常傳遞，從而阻斷了 Neddylation修飾激活Cullin蛋白參與的泛素複合體，抑制癌細胞的增生。該抑制劑被美國國家癌症研究中心(NCI)作為重要的候選抗腫瘤藥物進行I和II/III 其月人^本Ife床試驗石開究(http: //www.cancer, gov/drugdictionary?cdrid=596795),但至今尚未報導腫瘤抑制劑MLN4924對病毒有抑制作用。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種腫瘤抑制劑MLN4924在製備抗病毒藥物中的應用。
[0006]本發明的技術方案概述如下:
[0007]腫瘤抑制劑MLN4924在製備抗病毒藥物中的應用。
[0008]通過實驗證明在抗腫瘤臨床人體試驗中有較好表現的小分子抑制劑MLN4924具有較強的抗病毒活性，通過抑制病毒輔助蛋白作用，能夠達到大於80%的抑制病毒複製。由於該藥物具有較長的前期實驗性臨床應用經驗，藥物作用效果強，可大規模生產，因而具有很大的潛力成為高效抗病毒藥物。
[0009]利用小分子藥物抑制病毒蛋白主導的Neddylation激活下的泛素系統，檢測腫瘤抑制劑MLN4924在製備抗病毒藥物中的應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1為MLN4924抑制宿主細胞內Cullin4A蛋白的正常Neddylation修飾。[0011]圖2為MLN4924有效阻斷病毒蛋白Vpx誘導宿主SAMHDl蛋白降解。
[0012]圖3為細胞內高表達Neddylation介導蛋白UBE2M突變體有效抑制病毒蛋白Vpx功能。
[0013]圖4A為腺病毒蛋白E4of6識別CRL5E3複合體降解P53蛋白示意圖；
[0014]圖4B為MLN4924有效抑制腺病毒E4of6蛋白誘導P53蛋白降解。
[0015]圖5為MLN4924有效抑制慢病毒在PMA誘導後的巨噬細胞狀態下THP-1細胞內複製。
[0016]圖6為抗腫瘤藥物MLN4924抑制病毒泛素複合體功能示意圖。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施例和附圖對本發明作進一步的說明。[0018]本發明通過整合細胞宿主泛素複合體調節機制，研究在病毒蛋白劫持下的泛素複合體激活機制，篩選和檢驗特異性高，機體毒害性小且可行性大的小分子抑制劑來阻斷病毒輔助蛋白促進的病毒在巨噬細胞中複製，建立新型抗病毒藥物研究的新靶標。選用了的小分子抑制劑 MLN4924(化學式:C21H25N504S，編號:M425100，廠商:T0R0NT0 RESEARCHCHEMICALS INC.)實施例1
[0019]利用MLN4924 能夠有效的抑制 THP-1 細胞(2010 年從 NIH AIDS reagent program獲得:https://www.aidsreagent.0rg/reagentdetai1.cfm?t=cell lines&id=142) 內Cullin4A蛋白與類泛素分子Nedd8的結合，從而有效的阻止了 CRLs泛素E3複合體的變構激活。(見圖1)。實施例2
[0020]病毒蛋白誘導宿主蛋白泛素化降解檢測系統:
[0021]本發明中，宿主基因SAMHDl和P53表達質粒均通過提取THP-1細胞的cDNA，利用PCR擴增目的基因構建進入哺乳細胞表達載體p⑶NA3.1 (Invitrogen:http: //tools,lifetechnologies.com/content/sfs/vectors/pcdna3.1+, pdf)中。再利用月旨質法轉染將相應的宿主基因和病毒編碼基因轉入人胚胎腎細胞HEK293T (2010年購自ATCC:httD://www.atcc.0rg/Products/All/CRL-3216.aspx)中，48小時後，利用免疫印跡法檢測相應蛋白的表達情況，所有實驗結果均使用ImageJ軟體進行定量分析(圖2，圖3，圖4)。(I)MLN4924強效阻斷了慢病毒(Lentivirus)病毒蛋白Vpx識別CRL4(DCAFl)複合體促進
[0022]抗病毒因子SAMHDl的降解(圖2);平行的機制性研究再次證明了 Vpx_CRL4病毒複合
[0023]體受Nedd8修飾途徑中直接由UBE2M參與Nedd8分子傳遞和調控。多途徑幹擾UBE2M
[0024]蛋白正常表達或者功能，均明顯阻斷Vpx誘導降解抗病毒蛋白SAMHDl (圖3)；
[0025](2)MLN4924 有效阻斷腺病毒(Adenovirus)病毒蛋白 E4of6 識別 CRL5 (ElonginB/C)復
[0026]合體促進重要調節蛋白P53的泛素化降解，恢復宿主細胞內的正常功能性調節(圖4)。實施例3
[0027]病毒侵染試驗系統:
[0028]選用50ng/ml丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)刺激後的單核細胞系THP-1(購自ATCCMt為檢測系統。病毒侵染前6小時加入MLN4924達到IOOnM濃度，對照組使用溶劑DMSO與細胞共孵育，之後分別加入30ul含有濃縮後的無細胞的類人猿免疫缺陷病毒SIV病毒上清(病毒侵染報告質粒來自於美國凱斯西儲大學分子生物學和微生物學系Jacek Skowronski,相關文章已發表Hrecka，K.2011，Nature474，658-661)。72小時後，收細胞螢光顯微鏡觀察後用流式細胞儀進行GFP陽性細胞篩選(病毒侵染陽性)，收穫數據進行侵染性分析(圖5)。
[0029]重複試驗顯示MLN4924阻斷了病毒蛋白結合後的CRL E3泛素連接酶功能，對SIV在巨噬細胞內複製達到大於80%的抑制(圖5和圖6)。
[0030]圖 6 中(NAE:neddy8 蛋白激活酶；UBE2M/UBE2F:Nedd8 蛋白結合酶；Rbxl/Rbx2:E3泛素連接酶蛋白；E2:泛素結合酶；Ubiquitin(Ub):泛素蛋白)
[0031]抗腫瘤藥物MLN4924潛在抗病毒作用靶點見表1。
[0032]表1
[0033]
【權利要求】
1.腫瘤抑制劑MLN4924在製備抗病毒藥物中的應用。
【文檔編號】A61K31/519GK103520163SQ201310500094
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月22日 優先權日:2013年10月22日
【發明者】於曉方, 魏偉, 郭浩然 申請人:天津大學