生脈注射液中微量蛋白的測定方法

2023-06-16 15:48:51

專利名稱：生脈注射液中微量蛋白的測定方法
技術領域：
本發明涉及藥物分析技術領域，具體是一種測定生脈注射液中微量蛋白的方法。
背景技術：
生脈注射液是臨床應用多年的中藥注射劑，主要用於治療感染性休克、心源性休克和心肌梗塞等。生脈注射液臨床不良反應包括過敏性皮疹、接觸過敏性皮炎、腹脹、低血壓、心動過速等，其中過敏反應發生率最高。引起生脈注射液過敏反應的原因很多，而蛋白等大分子物質是主要的致敏原。目前，檢測過敏反應的方法一般採用動物試驗的方法，例如用豚鼠、大鼠試驗等。但這類試驗至少有2個缺陷1.檢測周期過長，不適於中間體的測定； 2.靈敏度低，對產品中含有潛在致敏危險的微量蛋白無法檢出。鑑於以上情況，急需一種靈敏度高，可以快速測定生脈注射液中微量蛋白的方法， 以監控生脈注射液生產過程中的質量，防止臨床使用中的過敏反應。

發明內容
本發明的目的是提供一種靈敏度高，可以快速測定生脈注射液中微量蛋白的方法。本發明的目的是通過採用以下技術方案來實現的
具體地說，本發明採用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定生脈注射液中微量蛋白的方法， 操作步驟如下
1.製備生脈抗原取人參、麥冬、五味子適量，加水提取，過濾，濾液加入乙醇，收取沉澱物，凍幹，製得生脈抗原；
2.抗生脈抗原抗體的製備用生脈抗原免疫家兔製備兔抗生脈抗原抗體；
3.酶聯免疫吸附試驗(ELISA)採用酶聯免疫吸附試驗法測定生脈注射液中的微量蛋白。
生脈抗原的製備中，原藥材人參、麥冬、五味子的質量比為10:32. 1:15.6。優選操作方法如下
1.製備生脈抗原取質量比為10:32.1:15.6的原料藥人參、麥冬、五味子，水煮回流提取，回流液過濾，濾液用乙醇沉澱，過濾，收集沉澱物，沉澱物水復溶後凍幹，即得生脈抗原；
2.抗生脈抗原抗體的製備抗原用完全福氏佐劑初次免疫後，用不完全佐劑紐西蘭兔足趾內或皮下多點注射，劑量以所含蛋白計為0.5-5mg/只。數次免疫後紐西蘭兔動脈採血，分離血清合併，封裝，10-20°C凍存，用於純化免疫球蛋白G，製得抗生脈抗原抗體；
3.酶聯免疫吸附試驗(ELISA)
稱取生脈抗原:3mg-15mg，加包被液配製為2-50mg/ml儲存液備用。用包被液將生脈抗原儲存液倍比稀釋為100 μ g/ml-2ug/ml濃度範圍，100 μ 1/孔包被在96孔聚乙烯酶標板上；待測生脈注射液每批號3孔以上，每孔100 μ 1包被。4°C溼盒過夜；棄去溶液，磷酸鹽緩衝溶液洗2-3遍，拍幹；用5%小牛血清溶液(溶劑為磷酸鹽緩衝溶液溶液，pH7.4)封閉 10-15分鐘；棄去溶液，加入100 μ 1 1 100稀釋的兔抗生脈血清(一抗)1-3小時；棄去溶液；磷酸鹽緩衝溶液洗4-5遍，拍幹；加入100 μ 1 1 3000辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G溶液(二抗，磷酸鹽緩衝溶液稀釋)避光室溫孵育1-3小時；棄去溶液，磷酸鹽緩衝溶液洗4-5遍，拍幹；加100 μ 1鄰苯二胺/過氧化氫(0PD/H202)底物磷酸緩衝液，臨用前10-15分鐘配製稱取10-15mg鄰苯二胺，用10_15ml磷酸緩衝液溶解，臨用前加10 μ 1 過氧化氫，混勻，每孔加100 μ 1進行顯色。顯色適當後，加100 μ 1的2mol · L硫酸終止反應，用酶標儀在490 nm處記錄吸收度。以log濃度對吸收度做非線性模擬曲線，然後選擇適當的線性範圍做線形模擬。根據標準曲線計算待測樣本的抗原含量。最佳操作方法如下
1.製備生脈抗原取質量比為10:32. 1:15.6的原料藥人參、麥冬、五味子，水煮提取 1-4小時，或回流10-180分鐘，回流液過濾，濾液用45%-85%乙醇沉澱，過濾，收集沉澱物，沉澱物水復溶後凍幹，即得生脈抗原。2.抗生脈抗原抗體的製備抗原用完全福氏佐劑配製，紐西蘭兔足趾內或皮下多點注射進行初次免疫，劑量以所含蛋白計為0. 5-3mg/只。2-3周後用不完全福氏佐劑配製抗原，紐西蘭兔足趾內或皮下多點注射進行1-4次免疫，紐西蘭兔耳中動脈採血Ι-aiil，分離血清，測定抗體滴度，如果抗體稀釋度小於10_5時，仍然呈現陽性反應，則一周後加強免疫一次，再一周後紐西蘭兔頸總動脈採血，分離血清合併，封裝，20°C凍存，用於純化免疫球蛋白G，製得抗生脈抗原抗體。3.酶聯免疫吸附試驗(ELISA)稱取生脈抗原5mg_10mg，加包被液(0. 05mol. L—1 碳酸鹽緩衝液，PH9.6)配製為5-20mg/ml儲存液備用。用包被液將生脈抗原儲存液倍比稀釋為80 μ g/ml-10 μ g/ml濃度範圍，100 μ 1/孔包被在96孔聚乙烯酶標板上；待測生脈注射液每批號3孔以上，每孔100 μ 1包被。4°C溼盒過夜；棄去溶液，磷酸鹽緩衝溶液洗2遍， 拍幹；用5%小牛血清溶液(溶劑為磷酸鹽緩衝溶液溶液，pH 7. 4 )封閉10分鐘；棄去溶液，加入ΙΟΟμΙ 1 100稀釋的兔抗生脈血清(一抗)2小時；棄去溶液；磷酸鹽緩衝溶液洗5遍，拍幹；加入100 μ 1 1 :3000辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G溶液(二抗，磷酸鹽緩衝溶液稀釋)避光室溫孵育2小時；棄去溶液，磷酸鹽緩衝溶液洗5遍，拍幹； 加100μ 1鄰苯二胺/過氧化氫(0PD/H202)底物磷酸緩衝液，臨用前10分鐘配製稱取IOmg 鄰苯二胺，用IOml磷酸緩衝液溶解，臨用前加10 μ 1過氧化氫，混勻，每孔加100 μ 1進行顯色。顯色適當後，加100 μ 1的2mol · L硫酸終止反應，用酶標儀在490nm處記錄吸收度。 以log濃度對吸收度做非線性模擬曲線，然後選擇適當的線性範圍做線形模擬。根據標準曲線計算待測樣本的抗原含量。生脈抗原系以生脈藥材為原料，生產中醇沉工藝不徹底得到的殘留物。由於醇沉工藝的主要目的是去除植物蛋白，得到的殘留物又能與特異的Bradford蛋白反應試劑作用，提示製備的生脈抗原主要為殘留的植物蛋白。經SDS電泳分析抗原是多種殘留蛋白混合物。三味中藥材中五味子抗原的蛋白含量最高，達到19.7%，紅參次之約為8.0%，麥冬最少，僅為5. 4%。生脈抗原的蛋白含量約為11.標準曲線的建立，檢測限及定量限的確定以J490 nm值為橫坐標，抗原濃度的對數值為縱坐標，非線性四參數回歸方程為 Y= (0. 147-2. 097)/(1+(χ/16. 247) L238) +2. 097，r2=0. 999。在 2. 0-30. 0 μ g · mL_1 呈明顯線性，分別按照陰性平均值+3倍標準偏差和陰性平均值+10倍標準偏差(/7=12，重複次數=10)計算方法的檢測限和定量限約為0.566和1.431yg ^mr1 (見表1)。由於所製備的生脈抗原的蛋白含量約為10%，因此本發明對抗原活性雜質的檢測限和定量限應低於 0. 566μ g · ml-1 禾口 1. 431 μ g · ml-1。
表1. ELISA檢測法的檢測限及定量限
權利要求
1.一種生脈注射液中微量蛋白的測定方法，包括如下操作步驟(1)製備生脈抗原取質量比為10:32.1:15.6的原料藥人參、麥冬、五味子，水煮回流提取，回流液過濾，濾液用乙醇沉澱，過濾，收集沉澱物，沉澱物水復溶後凍幹，即得生脈抗原；(2)抗生脈抗原抗體的製備抗原用完全福氏佐劑初次免疫後，用不完全佐劑紐西蘭兔足趾內或皮下多點注射，劑量以所含蛋白計為0. 5-5mg/只；數次免疫後紐西蘭兔動脈採血，分離血清合併，封裝，10-20°C凍存，用於純化免疫球蛋白G，製得抗生脈抗原抗體；(3)酶聯免疫吸附試驗稱取生脈抗原:3mg-15mg，加包被液配製為2-50mg/ml儲存液備用；用包被液將生脈抗原儲存液倍比稀釋為100 μ g/ml - 2ug/ml濃度範圍，ΙΟΟμΙ/孔包被在96孔聚乙烯酶標板上；待測生脈注射液每批號3孔以上，每孔100 μ 1包被；4°C溼盒過夜；棄去溶液，磷酸鹽緩衝溶液洗2-3遍，拍幹；用5%小牛血清溶液封閉 10-15分鐘；棄去溶液，加入100 μ 1 1 100稀釋的兔抗生脈血清1-3小時；棄去溶液；磷酸鹽緩衝溶液洗4-5遍，拍幹；加入100 μ 1 1 3000辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白G溶液避光室溫孵育1-3小時；棄去溶液，磷酸鹽緩衝溶液洗4-5遍，拍幹；加100 μ 1鄰苯二胺 /過氧化氫底物磷酸緩衝液，臨用前10-15分鐘配製稱取10-15mg鄰苯二胺，用10_15ml磷酸緩衝液溶解，臨用前加10 μ 1過氧化氫，混勻，每孔加100 μ 1進行顯色；顯色適當後，加100 μ 1的2mol · L硫酸終止反應，用酶標儀在490 nm處記錄吸收度；以log濃度對吸收度做非線性模擬曲線，然後選擇適當的線性範圍做線形模擬，根據標準曲線計算待測樣本的抗原含量。
2.根據權利要求1所述的測定方法，其特徵在於所述步驟(1)水煮提取1-4小時，所用乙醇濃度為45-85%。
3.根據權利要求1所述的測定方法，其特徵在於所述步驟(1)回流10-180分鐘，所用乙醇濃度為45-85%。
4.根據權利要求1所述的測定方法，其特徵在於所述步驟(2)紐西蘭兔足趾內或皮下注射免疫，劑量以所含蛋白計為0. 5-;3mg/只。
全文摘要
本發明公開了生脈注射液中微量蛋白的測定方法，該方法包括水提取醇沉澱法製備抗原；家兔免疫法製備抗生脈抗原血清並進一步純化製備抗體；採用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定生脈注射液中的微量蛋白含量。本發明解決了生脈注射液中微量蛋白含量無法快速檢測的難題，對提高生脈注射液產品的質量，防止臨床過敏反應具有重要意義。
文檔編號G01N33/543GK102175854SQ20111000287
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月7日 優先權日2011年1月7日
發明者戴德玲, 林愛琴, 歐陽強, 王光鳳 申請人:江蘇蘇中藥業集團股份有限公司