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抗B型肝炎病毒表面抗原的雜交瘤細胞株及其單克隆抗體的製作方法

2023-06-05 21:40:11 2

專利名稱:抗B型肝炎病毒表面抗原的雜交瘤細胞株及其單克隆抗體的製作方法
技術領域:
本發明涉及生物製劑,具體地涉及一種分泌抗B型肝炎病毒表面原抗(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)的單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其所分泌的單克隆抗體。
背景技術:
HBsAg是診斷B型肝炎病毒感染的重要標誌。目前國內外HBsAg檢測試劑盒多是利用抗-HBsAg單克隆抗體或多克隆抗體建立的ELISA檢測方法。各種試劑盒使用的抗體不同,檢測變異B肝病毒的能力不同。目前的研究結果顯示,國內的HBsAg檢測試劑盒檢測變異株的能力不佳,主要原因是沒有可以很好的識別變異株的單克隆抗體。因此有必要研發出可以檢測野生和變異HBsAg的單克隆抗體,建立檢測方法,以顯著降低HBsAg變異株的漏檢率。
HBsAg變異的原因非常複雜。目前認為B肝疫苗免疫後抗HBV免疫球蛋白的形成,以及高效價免疫球蛋白預防,藥物的壓力以及病毒的持續感染與HBV突變有關。使用高效價免疫球蛋白也會導致HBV S基因突變,肝移植病人使用高效價免疫球蛋白後仍然有約30%的人感染HBV。
自從上世紀80年代推廣B肝疫苗接種預防HBV感染以來,HBV感染的流行率顯著降低,對人類的健康起到了很大作用。但是隨著疫苗應用年限的延長,可逃避B肝疫苗的S基因突變的免疫逃避株越來越多。目前報導,我國B肝疫苗和HBIG母嬰阻斷失敗者,S基因變異率約為20%-40%;我國單純B肝疫苗免疫後攜帶者變異率為31%。表面抗原變異株仍然具有致病性和傳播能力,可能成為潛在的傳染源,可能突破人群已有免疫力形成新的感染而成為新的公共衛生問題。因此,研究S基因突變株的預防和診斷,對控制HBV的感染,進行HBV感染流行的監測以及獻血員的篩查有重要意義。
HBV S基因突變株的預防和診斷對獻血員的篩查也有重要意義。目前我國對獻血員的篩查主要是通過血清學的方法。B肝變異株的出現給血液製品的篩查提出了問題。變異株與野生株HBsAg的抗原性有很大改變;表面抗原「a」決定簇145等位點胺基酸變異後,抗原性會發塵較大改變,約60%變異表面抗原與針對野生型HBsAg的單克隆抗體的抗原反應性減弱或消失,用國內外現行表面抗原診斷試劑盒不能檢測出,漏檢率從12%-90%不等。變異株感染的病人容易漏檢,變異株汙染的血液製品也不易發現,對HBV的預防控制帶來困難。
目前用於檢測HBV突變的方法主要有直接測序、有限稀釋PCR、克隆篩選和特異基因序列固相聚合酶鏈反應(SS-SPPCR)。特異基因序列固相聚合酶鏈反應(SS-SPPCR)是檢測HBV基因點突變的和區分野毒株與變異株的混合感染靈敏而特異的新方法。這些方法檢測基因突變的特異性很好,但費用昂貴,需要許多大型儀器設備和熟練的技術人員,操作複雜,檢測時間長,不易在我國推廣使用。
檢測HBsAg的常用方法是ELISA,決定方法靈敏性和特異性的關鍵是有合適的抗-HBsAg的單克隆抗體。目前有許多研究單位製備了可以應用於臨床檢測的相關單克隆抗體,但主要是用於檢測野生株,可以較好識別變異株的單克隆抗體迄今尚未見報導。因此,篩選可以識別變異株的單克隆抗體具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是為了解決上述背景技術存在的不足,提出製備一種抗-HBsAg的雜交瘤細胞株及其分泌的單克隆抗體,使其製備的試劑能在檢測出B肝病毒野生株的同時還能檢測出多種B型肝炎病毒變異株。
本發明所述雜交瘤細胞株是通過免疫、融合以及篩選得到的,屬於鼠源雜交瘤細胞D12E9F11,其CCTCC保藏號為200505,它能分泌抗HBsAg的單克隆抗體。
該雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體能同時與野生型和突變型HBsAg進行特異性的結合反應。
本發明所述雜交瘤細胞的特徵細胞系名稱(Cell line Name)鼠源雜交瘤細胞D12E9F11種名(Species)Mouse衍生組織(Tissue Derived)小鼠骨髓瘤細胞SP2/0形態學(Morphology)Lymphoblast傳代培養液(Medium and Supplement)RPMI1640 90%;FCS10%生長條件(Growth Condition)37℃,CO25%凍存基質(Freeze Medium)FCS 90%,DMSO 10%
分泌物(抗體)特徵抗體類別1gGl抗體效價上清≥1×103ELISA腹水≥1×107ELISA抗體親和力用於野生型HBsAg檢測靈敏度可以達到0.5ng/ml,超過我國食品與衛生監督局頒布的標準(標準為1.0ng/ml),檢測常見變異Gly145Arg HBsAg的靈敏度可以達到1.0ng/ml。
存活性(Viability)≥90%本發明用途直接用途建立可以同時檢測B肝病毒突變株和野生株在內的B肝病毒表面抗原的臨床檢測實驗技術。包括ELISA,膠體金免疫滲析,多種B肝病毒抗原的固相與液相分析,以及多種免疫病理檢測技術等。這些方法的建立,能在很大程度上突破常規B肝病毒表面抗原檢測試劑在多種變異株檢測上的限制。
間接用途採用本細胞株分泌抗體所開發的實驗技術與試劑,可廣泛地用於B肝的基礎、臨床與流行病學研究,尤其是用於對獻血人員中B肝病毒變異株感染者的篩選。
本發明對推動我國病毒性肝炎的防治與研究,對進一步推進B肝的臨床、流行病學發展以及預防輸血性肝炎的傳播具有及其重要的價值。
具體實施例方式
一、抗-HBsAg的單克隆抗體細胞株的建立1、免疫原的製備免疫原為從HBV感染者血清中分離的HBsAg。
2、免疫動物取HBsAg 20ug稀釋在100ul生理鹽水中,加入等量的氫氧化鋁佐劑,混勻後,在BALB/c小鼠(6周齡)頸背部皮下多點注射。間隔2和4周後,取同量抗原加不完全佐劑追加免疫兩次,免疫結束後採集少許鼠血,檢測HBsAb效價。融合前2天,用相同劑量抗原腹腔注射追加免疫。
3、免疫效價檢測使用上海科華生物公司HBsAg預包被96孔聚苯乙烯板檢測免疫後小鼠血清效價檢測。
鼠血清用含10%牛血清PBS以102-106倍稀釋,加入96孔板,0.1ml/孔,37℃,60分鐘。甩去孔中液體,扣幹,用洗滌液注滿各孔,靜置15秒,甩去孔中液體,拍幹。重複5次。每孔加l∶4000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG 50ul於各孔中,37℃,45分鐘。重複上洗滌。加50ul含有0.1%(W/V)鄰苯二胺0.1%,50ul雙氧水PH5.0檸檬酸磷酸緩衝液,振蕩混勻,置37℃,15分鐘。用1M硫酸終止顯色後,振蕩混勻,在492nm波長讀數。以測定值與對照值的比≥2.1為陽性來判斷免疫鼠血清的校價。
3、細胞融合建株術次加強免疫後,無菌取小鼠脾臟,收集脾細胞,用無血清培養液洗3次,計數並測定細胞活力。收穫對數生長期的骨髓瘤細胞,作活細胞計數,細胞活力應不低於95%。將1×108脾細胞與2×107骨髓瘤細胞在50ml尖底離心管中混勻,離心,棄去上清液,加入0.7ml分子量為4000的PEG作為融合劑,使其融合,用HAT選擇培養基培養,使雜交瘤細胞能生長,待細胞長至105/ml時,同上免疫效價測定法篩選檢測細胞分泌抗體情況;4、有限稀釋法對陽性克隆的克隆化培養用彎吸管吹打雜交瘤細胞培養板中孔內的克隆,懸浮於完全培養液中。計數細胞,調整細胞濃度至100個/ml、50個/ml、10個/ml。分別將三種密度的雜交瘤細胞懸液接種於含飼養細胞的96孔培養板中,每孔加0.1ml,使每孔平均含10、5、1個細胞。在37℃、5%CO2及飽和溼度條件下靜置培養。1周後可半量換液。培養10-14天取培養上清液進行同上免疫效價測定法篩選檢測細胞分泌抗體情況。取第一次克隆化培養後抗體分泌水平最好的20個孔中的細胞進行第二次克隆化培養。方法同上。直到100%的克隆分泌特異性抗體為止。篩選出一株抗體性質最好的細胞,將陽性克隆進一步擴大培養,用10%DMSO的培養液配成106/ml細胞,凍存。共建一株穩定分泌抗體細胞株。命名為D12E9F11。
二、單克隆抗體的製備製備含特異性單克隆抗體的腹水選用BALB/C雌性經產鼠,在接種雜交瘤細胞前1周,先給小鼠腹腔注射0.5ml降植烷。收集生長良好的雜交瘤細胞,離心洗滌1次,重懸浮於無血清培養液中,調整細胞密度,每隻小鼠腹腔注射106個雜交瘤細胞。接種細胞7-12天,可見小鼠腹部明顯膨大。消毒腹部皮膚,用5ml注射器接8號針頭,刺入腹腔,收集腹水。3000rpm離心15min,棄去上層油脂,吸取淡黃色腹水,分裝,-70℃保存備用。
三、單克隆抗體的純化取1ml製備的小鼠腹水,加入等量的飽和硫酸銨溶液,使達到50%的飽和度,室溫攪拌2小時,靜置過夜,12000rpm,4℃離心30分鐘,棄去上清。將沉澱物用PBS溶解,加入0.8體積的飽和硫酸胺溶液,使達到40%的飽和度,室溫攪拌2小時,靜置過夜,12000rpm,4℃離心30分鐘,棄去上清。將沉澱物用PBS溶解,加入0.7體積的飽和硫酸銨溶液,使達到35%的飽和度,室溫攪拌2小時,靜置過夜,12000rpm,4℃離心30分鐘,棄去上清。沉澱物用PBS溶解,放入透析袋中,將透析袋放入盛有1升PBS的容器中,透析24小時,其間換PBS兩次。測定純化抗體的濃度,並通過PAGE蛋白電泳觀察純化抗體,4℃保存備用。
四、單克隆抗體的免疫學性狀分析1、特異性測定用D12E9F11單抗包被後,用HBV核心抗原,以及非HBV抗原為待檢抗原,用HRP標記的抗-HBsAg多抗為檢測抗原測定。結果表明,除與HBV表面抗原反應外,與HBV核心抗原及對照抗原無特異性反應。
2、單抗免疫球蛋白類及亞類測定30ml細胞培養上清按25.8%加入固體硫酸銨4℃,2小時,3000轉離心30分鐘,溶液用0.1ml中性PBS溶解。用兔抗鼠1g分型血清(Sigma)作免疫雙擴散,24小時後觀察沉澱線。結果單抗為IgG1。
3、單抗識別HBsAg位點的分析同上用HBsAg包被96孔板,50ul HBsAb陽性病人血清,50ulHRP標記的單抗,37℃1小時,洗滌後同上加顯色液測492nm吸收值。以單抗腹水對同一HRP標記的單抗抑制為100%,以已知單抗對標記單抗的抑制為陰性對照,計算抑制率。抑制率為(1-測定OD/陰性對照OD)×100。≥50%的抑制率為陽性。結果27份表面抗體陽性血清對三組抗體均顯示了不同程度的抑制率(見表1),由此顯示自然感染後的抗體可以抑制單抗與HBsAg的反應,因此提示此單抗所識別的位點也存在於自然抗原上。
表1.競爭抑制法測定抗體結果

五、單抗的應用研究單抗檢測變異表面抗原的的能力應用ELISA對本株單抗識別常見HBV S基因變異抗原的能力進行檢測,並與8種國產常用HBSAg檢測試劑盒對比。檢測結果見表3。本單抗(D12E9F11)可以檢測出15種變異中的13種,8種常用HBsAg檢測試劑盒對變異株的檢測分別為武漢長立7種、廈門新創8種、萬泰7種、科華6種、榮盛8種、月亮灣6種、華美7種、愛恩地7種。單抗D12E9F11對變異HBsAg的檢出比率較常規試劑盒顯著為高,ELISA顯色強度也顯著高於試劑盒。
表2.實驗中表達野生及變異HBsAg的重組質粒


表3單抗D12E9F11和常用HBsAg檢測試劑盒檢測野生及變異HBsAg的比較。

注以S/N值判斷結果,S/N大於2.1為陽性,小於2.1為陰性。
表4單抗D12E9F11效價檢測

六、小結本專利發明採用常規單克隆抗體的製備技術,使用從HBV感染者血清中分離的HBsAg為免疫原免疫小鼠,經細胞融合、篩選後,成功的篩選到一株可以較好識別HBV變異株的單克隆抗體。識別的表位存在於天然表面抗原上。用此種單克隆抗體包被建立的ELISA方法,不僅可以檢測野生型HBsAg,還可以檢出除T123M/C124R和T123N以外的15種變異中的13種變異HBsAg,檢測變異株的能力明顯優於國內同類產品。該單克隆抗體檢測野生HBsAg的最低濃度達到0.5ng/mL,符合國家制定的標準。國內目前尚沒有報導有可以分泌檢測變異株的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。具有此種性質的細胞株是本單位的首創。
使用本發明的細胞株分泌的抗體建立的ELISA檢測表面抗原的方法可以取代目前國內HBV免疫逃避變異株檢測能力較差的現行HBsAg診斷試劑。在用於HBV變異株感染臨床檢測與研究的其他實驗技術,如免疫螢光檢測、免疫膠體金技術和放射免疫檢測等,也有很好的應用前景。本技術一旦實施,可廣泛地用於B肝的基礎、臨床與流行病學研究,尤其是用於對獻血人員中B肝病毒變異株感染者的篩選。對推動我國病毒性肝炎的防治與研究,對進一步推進B肝的臨床、流行病學發展以及預防輸血性肝炎的傳播具有及其重要的價值。
權利要求
1.一種雜交瘤細胞株,CCTCC保藏號為CCTCC-C200505,其能分泌抗HBV表面抗原的單克隆抗體。
2.一種由權利要求1所述的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體,該抗體特異性地抗HBV表面抗原。
全文摘要
本發明涉及一種雜交瘤細胞株,CCTCC保藏號為CCTCC-C200505,其能分泌抗HBV表面抗原的單克隆抗體。用此種單克隆抗體包被建立的ELISA方法,不僅可以檢測野生型HBsAg,還可以檢出除T123M/C124R和T123N以外的15種變異中的13種變異HBsAg,檢測變異株的能力明顯優於國內同類產品。該單克隆抗體檢測野生HBsAg的最低濃度達到0.5ng/mL,符合國家制定的標準。
文檔編號C12N5/18GK1693454SQ20051001864
公開日2005年11月9日 申請日期2005年4月30日 優先權日2005年4月30日
發明者楊東亮, 李方和, 田擁軍, 張振華, 龔勁松 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院

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