實施體積排阻色譜的設備和方法
2023-06-19 00:55:11
專利名稱：實施體積排阻色譜的設備和方法
技術領域：
本發明涉及實施體積排阻色譜的設備和方法。本發明的實施方式以在常規高效液相色譜或超高效液相色譜壓力及更高壓力下使用小顆粒的體積排阻色譜的設備和方法為特徵。
背景技術：
本發明將使用如下定義的以下術語，除非出現該術語的上下文要求不同的含義。色譜是用於濃縮或分離在混合物中發現的一種或更多種化合物的分離方法。化合物通常存在於樣品中。本文使用術語「樣品」廣泛地代表其中一個個體需要分析的任何混合物。術語「混合物」在含有一種或更多種溶解的化合物的流體的意義上使用。流體可包含水和/或其它液體和氣體。感興趣的化合物稱為被分析物。色譜是一種差異化的遷移過程。混合物中的化合物以不同的速率經過色譜柱，導致它們的分離。這種遷移通過與被稱為固定相的顆粒填衝床或多孔整體結構有關的被稱為流動相的流體的傳送而發生。在某些色譜模式下，差異化遷移由被分析物與固定相和流動相的親和性的差異而發生。體積排阻色譜(SEC)是基於水動力半徑來分離或孤立混合物中的各被分析物的一類色譜。在SEC中，分離因為被分析物探測多孔性固定相介質的體積的能力不同而發生。參見例如A. M. Striegel 等人,Modern Size-Exclusion Chromatography:Practice of GelPermeation and Gel Filtration Chromatography,第二版，Wiley, NJ, 2009 SEC 典型地用於分離大分子或分子的複合物。例如，非限制性地，許多生物來源的大分子例如脫氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，蛋白質、多糖、以及其片斷和複合物都用SEC分析。合成多聚物、塑料等也用SEC分析。SEC 一般使用具有顆粒填充床的柱子來實施。這種顆粒的填充床是分離介質或者固定相，流動相將流經所述介質或固定相。放置柱子使其與泵和樣品注射器流體相通。通過樣品注射器在壓力下將樣品混合物加載到柱子上，混合物和流動相在泵的推動下通過柱子。混合物中的化合物離開柱子或從柱子上洗脫，最大的化合物首先離開，最小的分子最後離開。放置柱子使其與檢測器流體相通，當溶液離開柱子時，檢測器能檢測溶液的性質的變化。檢測器將把這些變化作為圖(稱為色譜圖)登記和記錄，用於確定被分析物的存在與否。被分析物尚開柱子的時間是分子的大小的指不。分子的分子量能使用標準校正曲線來估算。用於體積排阻色譜的檢測器的例子是但不限於，折光率檢測器、紫外檢測器、光散射檢測器和質譜儀。
希望具有用於SEC技術的柱子，所述柱子能在高於5000psi的壓力和高流速下操作以加速分析時間。還希望具有附加的或提高的效率和解析度；減少的溶劑使用量；改善的與先進的檢測器的兼容性。希望具有帶如此固定相的柱子，所述固定相具有精確定義的孔隙結構和粒徑以產生可高重複的結果。最後，希望具有帶如此固定相的柱子，所述固定相具有與生物大分子相容的表面修飾基團。
發明內容
本發明的實施方式涉及用於實施SEC的設備和方法。本發明的實施方式在常規高效液相色譜(HPLC)和超高效液相色譜(UHPLC)壓力下和快流速下操作以加速分析時間，所述壓力從約IOOOpsi至約IOOOOpsi以及更高。本發明的實施方式以如此的固定相為特徵，其具有精確定義的孔隙結構和粒徑以產生可高重複的結果。本發明的實施方式以如此的固定相為特徵，其具有與生物大分子相容的表面修飾基團。在一個方面，本發明提供實施體積排阻色譜的設備，其包括 外殼，具有至少一個壁來限定具有進口和出口的腔；和容納於上述腔內的包含核和表面成分的固定相材料；其中,所述固定相材料包含由式I代表的顆粒或整體料(monolith)W- [X] -Q式I其中X是核成分，具有包含二氧化矽核材料、金屬氧化物核材料、有機-無機雜合物核材料或它們的一組嵌段聚合物的表面；W是氫或羥基；和Q不存在或是使與被分析物的靜電相互作用、範德華相互作用、氫鍵合相互作用或其它相互作用最小化的官能團。在本發明的實施SEC的設備的某些實施方式中，W和Q佔據了核成分材料X的自由價或核成分的表面。在本發明的設備的其它實施方式中，選擇W和Q以形成表面成分。在其它實施方式中，可選擇X以形成一種嵌段聚合物或一組嵌段聚合物。在其它實施方式中，固定相材料包含顆粒。在固定相材料包含顆粒的本發明的設備的實施方式中，其中顆粒狀固定相材料的顆粒具有平均粒徑分布為O. 4-3. O微米；O. 5-3. O ；0. 6-3. O ；0. 7-3. O ；0. 9-3. O 或 I. 0-3. O 微米的直徑。在本發明的設備的其它實施方式中，固定相材料包含整體料。在固定相材料包含顆粒的本發明的設備的實施方式中，固定相材料的整體料表現出具有O. 4-3. O微米；
0.5-3. O ；0. 6-3. O ；0. 7-3. O ；0. 9-3. O或I. 0-3. O微米的平均粒徑分布的顆粒填充的顆粒床的色譜效率和滲透性。在本發明的設備的其它實施方式中，固定相材料的顆粒或整體料具有O. 8至
1.7cm3/g；0. 9 至 I. 6cm3/g； I. O 至 I. 5cm3/g 或 I. I 至 I. 5cm3/g 的孔體積。在本發明的設備的其它實施方式中，腔能在以下柱進口壓力下實施體積排阻色譜高於IOOOpsi ；高於2000psi ；高於3000psi ；高於4000psi ；高於5000psi ；高於6000psi ;高於 7000psi ;高於 8000psi ;高於 9000psi ;高於 IOOOOpsi ;高於 15000psi ;或高於20000psi。在其它實施方式中，柱進口壓力為約IOOOpsi至約20000psi ;約5000psi至約 20000psi ;約 7000psi 至約 20000psi ;約 IOOOOpsi 至約 20000psi ;約 IOOOpsi 至約15000psi ;約 5000psi 至約 15000psi。在本發明的設備的某些實施方式中，X是二氧化矽核、二氧化鈦核、氧化鋁核、有機-無機雜化物核或包含脂肪族橋連的矽烷的有機無機雜化物核。在特定的實施方式中，X是包含脂肪族橋連的矽烷的有機-無機雜化物核。在某些其它特定的實施方式中，脂肪族橋連的矽烷的脂肪族基團是乙烯。在本發明的設備的其它實施方式中，Q是親水性基團、疏水性基團或不存在。在本發明的設備的一些實施方式中，其中Q是親水性基 團，Q是脂肪族基團。在其它實施方式中，所述脂肪族基團是脂肪族二醇。在其它實施方式中，Q用式2來表示
/r1 \ /r3 \
Z--C---Y——C--A
Vr2Av Xr4 /,^式2其中，η1 是 0-30 的整數；η2 是 0-30 的整數；R1、R2、R3和R4每次出現獨立地代表氫、氟、低級烷基、保護的或脫保護的醇、兩性離子或基團Z ；Z 代表a)通過固定相材料的表面與式3的部分之間的與共價或非共價的鍵的形成產生的表面連接基團(B1)x(R5)y(R6)zSi-式3:其中X是1-3的整數，y是0-2的整數，z是0-2的整數，且 x+y+z=3R5和R6每次出現獨立地代表甲基、乙基、正丁基、異丁基、叔丁基、異丙基、叔己基(thexyl)、取代或未取代的芳基、環烷基、支鏈烷基、低級烷基、保護的或脫保護的醇或兩性離子基團；B1 代表-OR7、-NR7，R7」、-OSO2CF3 或-Cl ;其中 R7、R7』 和 R7」 各自代表氫、甲基、乙
基、正丁基、異丁基、叔丁基、異丙基、叔己基、苯基、支鏈燒基或低級燒基；b)通過直接的碳-碳鍵形成或通過雜原子、酯、醚、硫醚、胺、醯胺、醯亞胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、雜環、三唑或尿烷鍵直接連接到X的表面雜合基團；或c)非共價連接到固定相材料的表面的被吸附基團；d)通過由固定相材料表面(當W為氫時)與乙烯基或炔基反應形成共價鍵產生的表面連接基團；Y代表直接的鍵；雜原子鍵；酯鍵；醚鍵；硫醚鍵；胺鍵；醯胺鍵；醯亞胺鍵；脲鍵；硫脲鍵；碳酸酯鍵；氨基甲酸酯鍵；雜環鍵；三唑鍵；尿烷鍵；二醇鍵；多元醇鍵；苯乙烯、乙二醇或丙二醇的低聚物；苯乙烯、乙二醇或丙二醇的聚合物；糖基、多支鏈糖基、樹狀高分子或分枝狀聚合物(dendrigraph)或兩性離子基團；且A 代表i)親水性末端基團； ii)氫、氟、氟烷基、低級烷基或Z基團；或iii)可官能化基團。在本發明的設備的某些實施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，η1是2-18或2_6的整數。在本發明的設備的其它實施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，η2為0-18或0-6的整數。在本發明的設備的其它實施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，η1是2-18的整數且η2是0-18的整數，η1是2_6的整數且其中η2是0_18的整數，η1是2_18的整數且η2是0-6的整數，或η1是2-6的整數且η2是0_6的整數。在本發明的設備的其它實施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，A代表i)親水性末端基團，且所述親水性末端基團是保護的或脫保護形式的醇、二醇、縮水甘油醚、環氧、三醇、多元醇、季戊四醇、乙氧基季戊四醇、1，3-二氧六環-5，5-二甲醇、三(羥甲基)氨基甲烷，、三(羥甲基)氨基甲烷聚乙二醇醚、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、單價、二價或多價糖基、多支鏈的糖、含有外部親水性基團的樹狀高分子、含有外部親水基團的分枝狀聚合物或是兩性離子基團。在本發明的設備的其它實施方式中，其中Q是式2的脂肪族二醇，A代表ii)氫、氣、甲基、乙基、正丁基、叔丁基、異丙基、低級燒基或基團Z。在本發明的設備的其它實施方式中，其中Q如式2所示，A代表iii)可官能化的基團，所述可官能化的基團是保護的或脫保護形式的胺、醇、矽烷、烯烴、硫醇、疊氮化物或炔烴。在一些實施方式中，所述可官能化的基團在隨後的反應步驟中產生新的表面基團，其中，所述反應步驟是偶聯、置換、自由基加成、氫化矽烷化、縮合、裂解(click)或聚合。在本發明的設備的某些實施方式中，Z代表通過直接的碳-碳鍵形成或通過雜原子、酯、醚、硫醚、胺、醯胺、醯亞胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、雜環、三唑或尿烷鍵直接連接到表面雜化基團。在其它實施方式中，Z代表非共價連接到材料的表面的被吸附的表面基團。該表面基團可以是交聯的聚合物或其它被吸附的基團。例子包括但不限於醇、胺、硫醇、聚胺、樹狀高分子或聚合物。在本發明的設備的一些實施方式中，外殼配有一個或更多個熔塊以容納固定相材料。在其它實施方式中，外殼配有一個或更多個能使該設備置於與樣品注射器設備、監測器或這兩者流體相通的配件。在另一個方面，本發明提供實施SEC的方法，該方法包括以下步驟
A)提供外殼，其具有至少一個壁來限定具有進口和出口的腔；和容納於所述腔內的包含核和表面成分的固定相材料；其中所述顆粒狀固定相包含由式I代表的具有核成分和表面成分的顆粒W- [X]-Q式I其中X是核成分，其具有包含二氧化矽核材料、金屬氧化物核材料、有機-無機雜化物核材料或它們的一組嵌段聚合物的表面；W是氫或羥基；且Q不存在或是使與被分析物的靜電相互作用、範德華相互作用、氫鍵合相互作用或其它相互作用最小化的官能團；B)以高於IOOOpsi的柱進口壓力向所述腔內加載樣品以使樣品流經所述固定相介質；和C)基於大小將樣品分離成一種或更多種成分。在本發明的方法的實施方式中，柱進口壓力高於2000psi ;高於3000psi ;高於4000psi ;高於 5000psi ;高於 6000psi ;高於 7000psi ;高於 8000psi ;高於 9000psi ;高於IOOOOpsi ;高於15000psi ;或高於20000psi。在其它實施方式中，柱進口壓力為約IOOOpsi至約 20000psi ;約 5000psi 至約 20000psi ;約 7000psi 至約 20000psi ;約 IOOOOpsi 至約20000psi ;IOOOpsi 至約 15000psi ;約 5000psi 至約 15000psi。在本發明的方法的另一個實施方式中，所述方法還包括以下步驟D)分離所述一種或更多種成分。在本發明的方法的另一個實施方式中，所述方法還包括以下步驟E)檢測所述一種或更多種成分。在本發明的方法的另一個實施方式中，所述方法還包括以下步驟D)分離所述一種或更多種成分；和E)檢測所述一種或更多種成分。在本發明的方法的某些實施方式中，其中樣品為生物大分子。在樣品是生物大分子的實施方式中，Q可以是親水性的。在一些實施方式中，Q是脂肪族基團。在其它實施方式中，所述脂肪族基團是脂肪族二醇。在其它實施方式中，Q由式2表示
權利要求
1.實施體積排阻色譜的設備，所述設備包括 外殼，其具有至少一個壁來限定具有進口和出口的腔；和 容納於所述腔內的包含核和表面成分的固定相材料； 其中，所述固定相材料包含由式I代表的顆粒或整體料W-[X]-Q 式I 其中 X是核成分，其具有包含二氧化矽核材料、金屬氧化物核材料、有機-無機雜合物核材料或它們的一組嵌段聚合物的表面； W是氫或羥基；和 Q不存在或是使與被分析物的靜電相互作用、範德華相互作用、氫鍵合相互作用或其它相互作用最小化的官能團。
2.如權利要求I所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，W和Q佔據了核成分X的自由價或所述核成分的表面。
3.如權利要求I所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，選擇W和Q以在所述核成分的表面上形成表面成分，X形成一種或一組嵌段聚合物。
4.如權利要求I所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述固定相包含顆粒。
5.如權利要求4所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述固定相材料的顆粒具有平均粒徑分布為O. 4-3. O微米的直徑。
6.如權利要求5所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述固定相材料的顆粒具有平均粒徑分布為I. 0-3. O微米的直徑。
7.如權利要求I所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述固定相包含整體料。
8.如權利要求7所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述固定相材料的整體料表現出用平均粒徑分布為O. 4-3. O微米的顆粒裝填的顆粒床的色譜效率和滲透性。
9.如權利要求8所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述固定相材料的整體料表現出用平均粒徑分布為I. 0-3. O微米的顆粒裝填的顆粒床的色譜效率和滲透性。
10.如權利要求I所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述固定相材料的顆粒或整體料具有O. 8至I. 7 cm3/g的孔體積。
11.如權利要求10所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述固定相材料具有I.O至1.5 cm3/g的孔體積。
12.如權利要求11所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述固定相材料具有從I.I至I. 5 cm3/g的孔體積。
13.如權利要求I所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述腔能夠在大於1000psi的柱進口壓力下實施體積排阻色譜。
14.如權利要求13所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述腔能夠在大於5000psi的柱進口壓力下實施體積排阻色譜。
15.如權利要求14所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述腔能夠在大於7000psi的柱進口壓力下實施體積排阻色譜。
16.如權利要求15所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述腔能夠在大於10000psi的柱進口壓力下實施體積排阻色譜。
17.如權利要求I所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，X是二氧化矽核、二氧化鈦核、氧化鋁核、有機-無機雜合物核或包含脂肪族橋接的矽烷的有機-無機雜合物核。
18.如權利要求17所述的實施體積排阻色譜的設備，其中X是包含脂肪族橋接的矽烷的有機-無機雜合物核。
19.如權利要求18所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述脂肪族橋接的矽烷的脂肪族基團是乙烯。
20.如權利要求I所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，Q是親水性基團。
21.如權利要求I所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，Q是疏水性基團。
22.如權利要求I所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，Q不存在。
23.如權利要求20所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，Q是脂肪族基團。
24.如權利要求23所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述脂肪族基團是脂肪族二醇。
25.如權利要求I所述的實施體積排阻色譜的設備,其中，Q由式2表示
26.如權利要求25所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，η1是2-18的整數。
27.如權利要求26所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，η1是2-6的整數。
28.如權利要求25所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，η2是0-18的整數。
29.如權利要求28所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，η2是0-6的整數。
30.如權利要求25所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，η1是2-18的整數且η2是0-18的整數。
31.如權利要求30所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，η1是2-6的整數且η2是0-18的整數。
32.如權利要求25所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，η1是2-18的整數且η2是0-6的整數。
33.如權利要求32所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，η1是2-6的整數且η2是0_6的整數。
34.如權利要求25所述的實施體積排阻色譜的設備，其中A代表i)親水性末端基團，且所述親水性末端基團是保護的或脫保護形式的醇、二醇、縮水甘油醚、環氧、三醇、多元醇、季戊四醇、乙氧基化季戊四醇、1，3- 二氧六環-5，5- 二甲醇、三(羥甲基)氨基甲烷，、三(羥甲基)氨基甲烷聚乙二醇醚、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、單價、二價或多價糖基、多支鏈的糖、含有外部親水性基團的樹狀高分子、含有外部親水基團的分枝狀聚合物或兩性離子基團。
35.如權利要求25所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，A代表ii)氫、氟、甲基、乙基、正丁基、叔丁基、異丙基、低級燒基、氣燒基或基團Z。
36.如權利要求25所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，A代表iii)可官能化基團，所述可官能化基團是保護的或脫保護的形式的胺、醇、矽烷、烯烴、硫醇、疊氮化物或炔烴。
37.如權利要求36所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述可官能化基團在隨後的反應步驟中能產生新的表面基團，其中，所述反應步驟是偶聯、置換、自由基加成、氫化矽烷化、縮合、裂解或聚合。
38.如權利要求I所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，所述外殼配備有一個或更多個熔塊以容納所述固定相材料。
39.如權利要求I所述的實施體積排阻色譜的設備，其中，外殼配備有一個或更多個能安置所述設備使其與進樣器、檢測器或這兩者流體連通的配件。
40.一種實施體積排阻色譜的方法，所述方法包括以下步驟 A)提供外殼，其具有至少一個壁來限定具有進口和出口的腔；和容納於所述腔內的包含核和表面成分的固定相材料； 其中所述固定相材料包含由式I代表的顆粒或整體料W-[X]-Q式I其中 X是核成分，其具有包含二氧化矽核材料、金屬氧化物核材料、有機-無機雜合物核材料或它們的一組嵌段聚合物的表面； W是氫或輕基；且 Q不存在或是使與被分析物的靜電相互作用、範德華相互作用、氫鍵合相互作用或其它相互作用最小化的官能團； B)以高於1000psi的柱進口壓力向所述腔內的所述固定材料上加載樣品並使樣品流經所述固定相介質；和 C)基於大小將樣品分離成一種或更多種成分。
41.如權利要求40所述的實施體積排阻色譜的方法，其中，所述柱進口壓力大於5000psi。
42.如權利要求41所述的實施體積排阻色譜的方法，其中，所述柱進口壓力大於7000psi。
43.如權利要求42所述的實施體積排阻色譜的方法，其中，所述柱進口壓力大於10000psi。
44.如權利要求40所述的實施體積排阻色譜的方法，其進一步包括以下步驟D)分離所述一種或更多種成分。
45.如權利要求40所述的實施體積排阻色譜的方法，其進一步包括以下步驟E)檢測所述一種或更多種成分。
46.如權利要求40所述的實施體積排阻色譜的方法，其進一步包括以下步驟D)分離所述一種或更多種成分；和 E)檢測所述一種或多種成分。
47.如權利要求40所述的實施體積排阻色譜的方法，其中，所述樣品是生物大分子。
48.如權利要求47所述的實施體積排阻色譜的方法，其中，Q是親水性的。
49.如權利要求48所述的實施體積排阻色譜的方法，其中，Q是脂肪族基團。
50.如權利要求49所述的實施體積排阻色譜的方法，其中，所述脂肪族基團是脂肪族二醇。
51.如權利要求40所述的實施體積排阻色譜的方法，其中，Q由式2表示
52.如權利要求40所述的實施體積排阻色譜的方法，其中，所述樣品是合成的有機聚合物。
53.如權利要求52所述的實施體積排阻色譜的方法，此處Q是疏水性部分。
54.降低體積排阻色譜分析中光散射檢測器獲得噪音的發生率的方法，該法包括以下步驟 A)提供外殼，其具有至少有一個壁以限定具有進口和出口的腔；和容納於所述腔內的包含核和表面成分的固定相材料； 其中所述固定相材料包含由式I代表的顆粒或整體料W-[X]-Q式I其中 X是核成分，其具有包含二氧化矽核材料、金屬氧化物核材料、有機-無機雜合物核材料或它們的一組嵌段聚合物的表面； W是氫或輕基；且 Q不存在或是使與被分析物的靜電相互作用、範德華相互作用、氫鍵合相互作用或其它相互作用最小化的官能團； B)以高於1000psi的柱進口壓力向所述腔的所述固定材料上加載樣品並使樣品流經所述固定相介質； C)基於大小將樣品分離成一種或更多種成分；和 D)使用光散射檢測器檢測所述一種或更多種成分。
55.降低體積排阻色譜分析中光散射檢測器獲得的鬼峰的發生率的方法，所述方法包括以下步驟 A)提供外殼，其具有至少有一個壁以限定具有進口和出口的腔；和容納於所述腔內的包含核和表面成分的固定相材料； 其中所述固定相材料包含由式I代表的顆粒或整體料W-[X]-Q式I其中 X是核成分，其具有包含二氧化矽核材料、金屬氧化物核材料、有機-無機雜合物核材料或它們的一組嵌段聚合物的表面； W是氫或輕基；且 Q不存在或是使與被分析物的靜電相互作用、範德華相互作用、氫鍵合相互作用或其它相互作用最小化的官能團； B)以高於1000psi的柱進口壓力向所述腔的所述固定材料上加載樣品並使樣品流經所述固定相介質； C)基於大小將樣品分離成一種或更多種成分；和 D)使用光散射檢測器檢測所述一種或更多種成分。
全文摘要
本發明涉及實施體積排阻色譜的設備和方法。本發明的實施方式以在常規高效液相色譜或超高效液相色譜壓力及更高壓力下使用小顆粒的體積排阻色譜的設備和方法為特徵。
文檔編號B01D15/34GK102858419SQ201080061579
公開日2013年1月2日 申請日期2010年12月15日 優先權日2009年12月15日
發明者E.S.P.布維耶, K.D.懷恩漢, T.H.沃特, U.D.諾伊 申請人:沃特世科技公司