一種功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的製備方法及其應用的製作方法

2023-06-19 00:00:41

專利名稱：一種功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗癌藥物載體，具體地說，是一種功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的製備方法及在體外Hela宮頸癌細胞治療中的應用。
背景技術：
癌症是嚴重危害人類健康的主要疾病之一，有效地治療癌症一直是世界矚目的研究課題。反義核酸技術是近年發展的一種基因治療腫瘤的有效方法，它以腫瘤發生相關基因為靶點，通過人工合成的反義寡核苷酸與之特異性互補結合，抑制靶向基因的表達而導致腫瘤細胞凋亡，具有高選擇性、高效率、低毒性等特點。但是由於單純的反義寡聚核苷酸很難進入腫瘤細胞或被降解而達不到治療效果。研究表明通過選擇合適的藥物載體輸送， 可大大提高治療惡性腫瘤的效果。因此，發展高效安全的基因載體系統在生物醫學領域中具有重要意義。圖1為已知的高嶺土納米管的透射電鏡圖。高嶺土納米管是一種類似碳納米管的一維納米管狀結構材料。高嶺土納米管是層狀結構矽酸鹽礦物，是由一層矽氧四面體和一層鋁氧八面體通過共同的氧原子互相連接形成一個晶層單元，為1 1型層狀矽酸鹽。高嶺土納米管的表面含有如下官能團-Si(Al)-0H，-Si-O-Al-和-Si(Al)-O,這些活性官能團使高嶺土的內表面帶正電荷，外表面帶負電荷，表面所帶電荷的不同為高嶺土納米管表面改性打下了基礎。高嶺土納米管表面改性可以通過物理、化學方法對高嶺土納米管表面進行處理，以改變其表面的物理化學性質(如表面電性、表面能、官能團、表面吸附性和反應特性等)。通過功能化修飾的高嶺土納米管在聚合物/納米高嶺土複合材料、生物醫學、 抗菌材料、貯能材料等領域有著廣闊的應用前景。與傳統的零維納米顆粒相比，高嶺土納米管在藥物載體上的應用具有如下優點 1)功能化的高嶺土納米管具有良好的生物相容性，對生物體系的毒性小；2)高嶺土納米管具有較大的比表面積，為藥物、蛋白質、DNA及核酸等提供了更多的負載空間，大大提高負載量；3)高嶺土納米管的表面特性使其可以被有效地表面功能化，通過修飾帶有不同功能的官能團，應用於不同生物體系的研究。生存素(survivin)是近年來發現的一種凋亡抑制蛋白(IAP)，它主要抑制凋亡中主要的效應蛋白酶caSpaSe3和caSpaSe7來介導凋亡的抑制。在多數惡性腫瘤組織中表達豐富，但在相應正常組織中不表達，這種選擇性表達特性使其成為目前惡性腫瘤診斷和治療的新靶點。而針對生存素(survivin)基因作為藥物治療靶點，負載其反義寡聚核苷酸的高嶺土納米管基藥物載體未見報導。

發明內容
本發明的目的，在於提出一種新型功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的製備方法。
本發明的另一目的，在於提出一種新型功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體對體外Hela宮頸癌細胞治療中的應用。為實現上述目的，本發明的技術解決方案是一種功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的製備，其特徵在於包括以下步驟A)將3-氨丙基三乙氧基矽烷溶解在甲苯中，其體積比為2 25，再加入高嶺土納米管粉末，高嶺土納米管粉末與3-氨丙基三乙氧基矽烷的質量體積比為0.6g 2ml ； 30-80HZ超聲波分散10-20分鐘；B)將上述混合物在65°C條件下回流攪拌反應20小時後，通過過濾得到反應產物；C)用甲苯和水洗滌處理得到的上述反應產物3-5次除去未反應的有機矽烷，烘乾乾燥後即獲得功能化高嶺土納米管粉末；D)取步驟C)中的功能化高嶺土納米管粉末溶解在水中，配成0. 2g/L的功能化高嶺土納米管水溶液；E)取一定量的功能化高嶺土納米管水溶液中加入20 μ mol/L的反義寡聚核苷酸， 反義寡聚核苷酸與功能化高嶺土納米管的體積比為1.5 1 ；再加入無菌二次蒸餾水，室溫下搖床反應4小時；F)待反應結束後，經1-2次離心處理，去掉上清液；G)將步驟F)所得物質重新分散到二次蒸餾水中，得到穩定的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸溶液。一種功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的應用，其特徵在於，介導反義寡聚核苷酸進入細胞，以較高的細胞轉染率，在體外Hela宮頸癌細胞治療中的應用。採用上述技術方案後，本發明的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的製備及應用具有以下優點1、製備方法簡單、快速；2、該載體具有轉染率高、靶向性強，抑制腫瘤細胞效果明顯；3、對不同的生物體系以功能化高嶺土納米管為載體輸送不同的靶向性生物分子或藥物為其它腫瘤或疾病的治療提供了一條新途徑。


圖1為已知的高嶺土納米管的透射電鏡圖；圖2為本發明實施例的功能化高嶺土納米管的透射電鏡圖；圖3為本發明實施例的帶有FAM螢光素標記的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體和Hela細胞孵育4小時後流式細胞儀測定其轉染率圖，未處理的Hela細胞作為對照；圖4為本發明實施例的採用噻唑藍法分別檢測功能化高嶺土納米管，裸露的反義寡聚核苷酸，功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體對Hela細胞孵育不同時間 (24,48,72小時)後的細胞抑制率示意圖，未處理的Hela細胞作為對照。
具體實施例方式以下結合實施例及其附圖對本發明作更進一步說明。圖2為本發明實施例的功能化高嶺土納米管的透射電鏡圖。本發明的新型功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的製備中，首先對高嶺土納米管進行功能化修飾，提高了其水溶性並使其表面帶正電荷，並通過靜電組裝負載反義寡聚核苷酸，構建成一種新型功能化高嶺土納米管反義核酸複合體。該複合體作用於體外培養的Hela宮頸癌細胞，可有效地介導反義核酸進入細胞，具有較高的細胞轉染率，並且顯著提高反義核酸促進腫瘤細胞凋亡效率，增強其抗腫瘤活性。實施例1本發明的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的製備，其特徵在於包括以下步驟a、將lml3_氨丙基三乙氧基矽烷(APTES)溶解在12. 5ml甲苯中，加入約0. 3克的高嶺土納米管粉末，充分30-80HZ超聲波分散10-20分鐘；b、將上述混合物在65°C條件下回流攪拌反應20小時後，通過過濾得到反應產物；c、用甲苯和水洗滌處理得到的上述反應產物3-5次除去未反應的有機矽烷，烘乾乾燥後即獲得功能化高嶺土納米管粉末；d、取2mg功能化高嶺土納米管粉末溶解在10毫升的水中，配成0. 2mg/ml的高嶺土水溶液；e、取上述高嶺土水溶液10 μ L，加入20 μ M反義寡聚核苷酸15 μ L，再加入無菌的二次蒸餾水至1ml，室溫下搖床反應4小時；f、待反應結束後，經1-2次離心處理，去掉上清液(即棄除溶液中游離的反義寡聚核苷酸)；g、將步驟f所得物質重新分散到二次蒸餾水中，得到穩定的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸溶液。實施例2本發明的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的製備，其特徵在於包括以下步驟a、將2ml3_氨丙基三乙氧基矽烷(APTES)溶解在25ml甲苯中，加入約0. 6克的高嶺土納米管粉末，充分30-80HZ超聲波分散10-20分鐘；b、將上述混合物在65°C條件下回流攪拌反應20小時後，通過過濾得到反應產物；c、用甲苯和水洗滌處理得到的上述反應產物3-5次除去未反應的有機矽烷，烘乾乾燥後即獲得功能化高嶺土納米管粉末；d、取2mg功能化高嶺土納米管粉末溶解在10毫升的水中，配成0. 2mg/ml的高嶺土水溶液；e、取上述高嶺土水溶液10 μ L，加入20 μ M反義寡聚核苷酸15 μ L，再加入無菌的二次蒸餾水至1ml，室溫下搖床反應4小時；f、待反應結束後，經1-2次離心處理，去掉上清液(即棄除溶液中游離的反義寡聚核苷酸)；g、將步驟f所得物質重新分散到二次蒸餾水中，得到穩定的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸溶液。實施例3本發明的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的製備，其特徵在於包括以下步驟a、將3ml3_氨丙基三乙氧基矽烷(APTES)溶解在37. 5ml甲苯中，加入約0. 9克的高嶺土納米管粉末，充分30-80HZ超聲波分散10-20分鐘；b、將上述混合物在65°C條件下回流攪拌反應20小時後，通過過濾得到反應產物；c、用甲苯和水洗滌處理得到的上述反應產物3-5次除去未反應的有機矽烷，烘乾乾燥後即獲得功能化高嶺土納米管粉末；d、取2mg功能化高嶺土納米管粉末溶解在10毫升的水中，配成0. 2mg/ml的高嶺土水溶液；e、取上述高嶺土水溶液10 μ L，加入20 μ M反義寡聚核苷酸15 μ L，再加入無菌的二次蒸餾水至1ml，室溫下搖床反應4小時；f、待反應結束後，經1-2次離心處理，去掉上清液(即棄除溶液中游離的反義寡聚核苷酸)；g、將步驟f所得物質重新分散到二次蒸餾水中，得到穩定的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸溶液。實施例4功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的應用功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的細胞轉染率的測定用帶有FAM螢光素標記的反義寡聚核苷酸取代單純的反義寡聚核苷酸製備功能化高嶺土納米管反義核酸複合體來考察該藥物載體的細胞轉染率。將帶有FAM螢光素標記的功能化高嶺土納米管反義核酸複合體加入到對數生長期的Hela細胞中，在37°C 5% CO2 飽和溫度下培養4小時。取未經任何處理的對數生長期的Hela細胞，作為陰性對照。胰酶消化後，用70%的乙醇固定。用流式細胞儀檢測他們的轉染率。該複合藥物的轉染率可以達到95%以上，說明功能化高嶺土納米管可以作為一種很好的藥物載體應用於生物領域。Hela宮頸癌細胞的培養Hela宮頸癌細胞株購買自中科院細胞庫。取每孔6000個Hela宮頸癌細胞在含 10%胎牛血清的MEM培養基，370C 5% CO2飽和溼度下培養，實驗選用對數期生長細胞。細胞抑制率的測定將功能化高嶺土納米管(f-HNTs)，裸露的反義寡聚核苷酸(naked ASODNs)和功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸(f-HNTs-APTES-ASODNs)分別加入到對數生長期的 Hela細胞中，在37°C 5% CO2飽和溫度下培養Mh。取未經任何處理的對數生長期的Hela 細胞，作為陰性對照，通過噻唑藍法(MTT)檢測細胞的抑制率。與裸露的反義寡聚核苷酸相比，功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體可明顯提高反義寡聚核苷酸的抑制腫瘤細胞的效率。裸露的反義寡聚核苷酸的腫瘤細胞抑制率為6 %，而功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的腫瘤細胞抑制率達到20%。實施例5功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的應用
除在37°C 5% CO2飽和溫度下培養48h，裸露的反義寡聚核苷酸的腫瘤細胞抑制率為7%，功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的腫瘤細胞抑制率達到25%外，其餘同實施例2。實施例6除在37°C 5% CO2飽和溫度下培養72h，裸露的反義寡聚核苷酸的腫瘤細胞抑制率為9%，功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的腫瘤細胞抑制率達到外，其餘同實施例2。以上實施例僅供說明本發明之用，而非對本發明的限制，有關技術領域的技術人員，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，還可以作出各種變換或變化。因此，所有等同的技術方案也應該屬於本發明的範疇，應由各權利要求限定。
權利要求
1.一種功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的製備方法，其特徵在於包括以下步驟A)將3-氨丙基三乙氧基矽烷溶解在甲苯中，其體積比為2 25，再加入高嶺土納米管粉末，高嶺土納米管粉末與3-氨丙基三乙氧基矽烷的質量體積比為0. 6g 2ml ；30-80HZ 超聲波分散10-20分鐘；B)將上述混合物在65°C條件下回流攪拌反應20小時後，通過過濾得到反應產物；C)用甲苯和水洗滌處理步驟B)得到的反應產物3-5次除去未反應的有機矽烷，烘乾乾燥後即獲得功能化高嶺土納米管粉末；D)取步驟C)中的功能化高嶺土納米管粉末溶解在水中，配成0.2g/L的功能化高嶺土納米管水溶液；E)取一定量的功能化高嶺土納米管水溶液中加入20μ mol/L的反義寡聚核苷酸，反義寡聚核苷酸與功能化高嶺土納米管的體積比為1.5 1 ；再加入無菌二次蒸餾水，室溫下搖床反應4小時；F)待反應結束後，經1-2次離心處理，去掉上清液；G)將步驟F)所得物質重新分散到二次蒸餾水中，得到穩定的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸溶液。
2.一種功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的應用，其特徵在於介導反義寡聚核苷酸進入細胞，以較高的細胞轉染率，在體外Hela宮頸癌細胞治療中的應用。
全文摘要
一種功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的製備方法及其應用，其步驟為將3-氨丙基三乙氧基矽烷溶解在甲苯中，再加入高嶺土納米管粉末；超聲波分散；將混合物回流攪拌反應後，通過過濾得到反應產物；用甲苯和水洗滌處理得到的上述反應產物除去未反應的有機矽烷，烘乾乾燥後即獲得功能化高嶺土納米管粉末；取功能化高嶺土納米管粉末溶解在水中，配成功能化高嶺土納米管水溶液；取一定量的功能化高嶺土納米管水溶液中加入反義寡聚核苷酸，反義寡聚核苷酸；再加入無菌二次蒸餾水，室溫下搖床反應；待反應結束後，經若干次離心處理，去掉上清液；將所得物質重新分散到二次蒸餾水中，得到穩定的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸溶液。
文檔編號A61K48/00GK102343101SQ201110203268
公開日2012年2月8日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者石寅峰, 賈能勤 申請人:上海師範大學