一種從植物微量組織中提取rna病毒核酸的方法
2023-07-03 22:34:31 1
專利名稱：一種從植物微量組織中提取rna病毒核酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種提純病毒核酸的方法，特別是一種從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法。
背景技術：
PCR和RT-PCR是DNA病毒和RNA病毒高靈敏度檢測的強有力工具。對植物病毒來說，RT-PCR方法與當前的其它檢測技術相比，不管在檢測靈敏度、特異性還是花費時間方面都有了長足的進步。由於GenBank資料庫中收錄了大量的病毒核酸序列，這對病毒特異的PCR引物設計提供了得天獨厚的優勢。但是，組織核酸的提取在PCR和RT-PCR實驗過程中是耗時且花體力的一個步驟。況且，沒有一種方法可以適合所有組織核酸的提取，例如，經典的Trizol提取方法就部分草本植物而言，可以獲得較為理想的結果，但是，就木本植物的葉組織而言，核酸提取的效率非常低；並且，在提取的核酸樣品中往往存在RT和PCR反應的抑制因子，這樣往往導致檢測結果的假陰性。因此，許多工作者在核酸提取方法上作了研究。
現有的病毒核酸提純方法主要有兩類其一是大量製備病毒顆粒，然後從病毒顆粒中將核酸與病毒蛋白(主要是外殼蛋白)分離，通過苯酚/氯仿抽提等方法去除蛋白質，純化其中的核酸；這一方法需要大量的感染病毒的組織，微微需要10g～300g組織來製備純化病毒；同時，製備病毒粒子需要進行超速離心等條件，製備時間長、條件要求高。
其二是從組織中提取總核酸(對於RNA病毒主要是總RNA)。由於寄主組織中總RNA製備物中主要是寄主的RNA，特別是核糖體RNA。總RNA中病毒RNA的相對含量不到1％，因此對於基於病毒核酸製備的病毒檢測容易造成假陽性等不可預期的結果。同時，總RNA提取液，如市售的Trizol溶液中往往含有氯仿等多種對人體和環境有害的物質，造成汙染。
發明內容
針對現有技術中存在的不足之處，本發明提供一種成本低廉、操作簡便、僅需微量樣品就能進行RNA病毒核酸分離的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法。
本發明為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現的提供一種從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法，依次包括以下步驟1)、將被病毒侵染的植物寄主組織，按照0.05-0.2克/100μl的比例在預冷的病毒粒子保護性緩衝溶液中研磨至勻漿，所述病毒粒子保護性緩衝溶液的pH值為5.0～9.0；2)、將上述勻漿轉移到0.2-1.5ml的塑料離心管中，室溫下靜止10～20分鐘，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；用弱鹼性緩衝溶液洗所述塑料離心管壁2～4次，洗滌完畢後，離心後吸除殘液；3)、加入焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的去離子水，升溫至70℃～100℃，保溫1～3分鐘，使病毒粒子解離，釋放出病毒核酸。
作為本發明的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法的一種改進將所製備的病毒核酸直接用於RT-PCR或低溫方式保存；或先將病毒核酸稀釋至9～10倍的體積，並加入與稀釋後病毒核酸體積比為2/3～1倍的異丙醇或體積比為3～4倍的酒精，沉澱獲得純化濃縮的病毒核酸。
作為本發明的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法的進一步改進步驟2)中將勻漿轉移到塑料離心管中，先將塑料離心管低速離心或者振蕩後，再室溫下靜止10～20分鐘。
作為本發明的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法的進一步改進步驟1)中，病毒粒子保護性緩衝溶液的濃度為0.01～1.0mol/L；步驟2)中，每次使用100-200μl弱鹼性緩衝溶液洗塑料離心管壁；步驟3)中，加入8μl～20μl的焦碳酸二乙酯處理的去離子水。
作為本發明的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法的進一步改進步驟1)中的病毒粒子保護性緩衝溶液是pH值為5.0～9.0的磷酸緩衝液、硼酸緩衝液、或PBST溶液；步驟2)中的弱鹼性緩衝溶液為PBST溶液。
作為本發明的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法的進一步改進步驟1)中的病毒粒子保護性緩衝溶液是pH7.2的PBST溶液。
作為本發明的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法的進一步改進步驟2)中的塑料離心管為0.5-1.5ml的聚丙烯離心管、聚苯烯離心管、聚四氟離心管，特別選擇為0.5-1.5ml的不進行矽烷化處理的聚丙烯離心管。
本發明的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法，具有如下優點1)、本發明方法操作簡便，可以不需要低溫冷凍離心機或超速離心機等儀器，提取時間為20～50分鐘；而常規方法需要多次使用低溫冷凍離心機或超速離心機，提取時間為1小時以上；2)、使用本發明之方法，提取核酸不使用氯仿和苯酚等有機溶劑，對環境和操作者友好；3)、本發明的最重要優點是僅需微量組織即可提取，因此製備成本極低，有利於節省成本；4)、本發明的方法能對組織中可能同時攜帶的病毒和基因顆粒可進行提取，用於檢測。
具體實施例方式
實施例1、在半夏脫毒快繁的組織培養過程中，各取0.2g待檢的半夏愈傷組織，在100μl預冷的PBST溶液、研缽中研磨至勻漿；各取100μl勻漿液分別轉移到0.5ml規格的塑料離心管中，低速離心後再在室溫下靜止15分鐘，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；每次用100μl PBST溶液洗離心管，共洗3次，洗滌完畢後，再離心後吸除殘液。分別加入8μl DEPC處理的去離子水；其中1管升溫至80℃保持1分鐘，使病毒粒子解離，釋放核酸。
PBST溶液其配製方法為溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4和2ml of tween-20於800ml去離子水中，用HCl調整其pH至7.2，加入0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)，37℃放置2小時，高溫滅菌，冷卻後使用。
所製備的病毒核酸直接加入黃瓜花葉病毒(CMV)CP基因擴增的RT-PCR反應體系，擴增獲得CMV CP基因的片段，進一步進行雜交檢測；確定是否有該病毒侵染；其中另1管升溫至80℃保持2分鐘，使病毒粒子解離，釋放核酸；所製備的病毒核酸直接加入芋花葉病毒(DsMV)3′末端基因擴增的RT-PCR反應體系，擴增獲得DsMV部分基因組的片段，進一步進行雜交檢測；確定是否有DsMV的侵染。以同時侵染CMV和DsMV的半夏植株(葉片)作為對照，以通過DsMV和CMV的ELISA檢測方法確定為脫病毒的種苗作為陰性對照，用本方法從同一陽性植株中同時檢測出DsMV和CMV，但是陰性對照沒有檢測到以上2種病毒；通過脫病毒處理的預傷組織中33.7％的樣品中已經脫除以上2種病毒。
實施例2、從黃瓜花葉病毒(CMV)系統侵染的番茄組織中製備CMV基因組RNA取0.1g系統侵染CMV的番茄組織，在預冷的磷酸緩衝液、研缽中研磨至勻漿；取100μl勻漿液轉移到1.5ml塑料離心管中，低速離心或者振蕩後再在室溫下靜止20分鐘，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；分別用150μl PBST溶液洗離心管3次，洗滌完畢後，再離心後吸除殘液；加入20μl DEPC處理的去離子水；升溫至80℃保持3分鐘，使病毒粒子解離，釋放核酸。
所製備的病毒核酸直接加入RT-PCR反應體系，擴增獲得CMV全長基因組RNA1、RNA2和RNA3的片段。
實施例3通過免疫捕捉方法從黃瓜花葉病毒(CMV)系統侵染的番茄組織中製備CMV基因組RNA取100μl用PBST或生理鹽水稀釋(1500倍)的CMV抗血清加入到1.0ml塑料離心管中，室溫下處理18分鐘，讓抗體充分吸附到離心管管壁上，然後倒去抗血清溶液，洗幹；將-80℃保存的0.5g系統侵染CMV的番茄組織，在1000μl PBST溶液、研缽中研磨至勻漿；取100μl勻漿液轉移到1.5ml塑料離心管離心管中，低速離心或者振蕩後再在室溫下靜止15分鐘，使病毒粒子與吸附在管壁上的抗體充分結合；倒去溶液；分別用100μl PBST溶液洗離心管3次，洗滌完畢後，再離心後吸除殘液；加入8μl DEPC處理的去離子水；升溫至80℃保持1分鐘，使病毒粒子解離，釋放核酸。
所製備的病毒核酸直接加入RT-PCR反應體系，擴增獲得CMV全長基因組RNA1、RNA2和RNA3的片段。
實施例4從馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒和馬鈴薯Y病毒複合感染馬鈴薯植株中製備3種病毒核酸取0.1g同時感染馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)和馬鈴薯M病毒的馬鈴薯葉組織(去中脈)於研缽中，加入200μl硼酸緩衝液充分研磨，然後取100μl提取物於DEPC處理的離心管中，24℃放置16分鐘；吸乾提取物，用200μl DEPC處理的1×PBST溶液衝洗管壁2次；短暫離心之後，吸乾殘留的PBST溶液，並加入10ul DEPC-H2O衝洗管壁，將離心管放置80℃變性2min，放置冰上3-10min；充分渦旋後，短暫離心，管底溶液即可作為RT-PCR的模板，同時獲得3條代表不同病毒核酸的條帶。
實施例5從菸草花葉病毒(TMV)侵染的菸草組織種製備TMV全長基因組RNA取0.05g系統侵染TMV的菸草組織，在PBST溶液和研缽中研磨至勻漿；取100μl勻漿液轉移到0.5ml塑料離心管中，室溫下靜止10分鐘，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；分別用100μl PBST溶液洗離心管3次，離心後吸除殘液；加入8μl DEPC處理的去離子水；升溫至80℃保持3分鐘，使病毒粒子解離，釋放核酸；所製備的病毒核酸點樣到硝酸纖維素膜上，用同位素標記的TMV探針檢測，檢測到TMVRNA雜交信號。
實施例6從侵染菜豆黃花葉病毒(BYMV)的美人蕉葉組織中製備病毒基因組RNA取0.05g感染BYMV的美人蕉葉組織，在PBST溶液和研缽中研磨至勻漿；取100μl勻漿液轉移到0.5ml塑料離心管中，室溫下靜止10分鐘，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；分別用100μl PBST溶液洗離心管3次，離心後吸除殘液；加入15μl DEPC處理的去離子水；升溫至80℃保持2分鐘，使病毒粒子解離，釋放核酸。
通過RT-PCR方法從製備的病毒核酸樣品中檢測到該病毒。
對照實施例1從200g菸草葉組織中提取黃瓜花葉病毒(CMV)，進而提取該病毒的基因組核酸取200g系統侵染CMV的菸草葉組織，加入200ml的PB緩衝液，勻漿3min，加入40ml氯仿，繼續勻漿2min，離心取上清，加入總體積6％的PEG6000，4℃攪拌4h，離心棄上清，沉澱懸浮於PB緩衝液，取上清，超速離心，沉澱懸浮於0.2M PB緩衝液。SDS-PAGE電泳檢測結果表明提純獲得的CMV濃度含量很低。取200ul病毒粗體液提取病毒的總核酸，經甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測，沒有檢測到病毒核酸的條帶。
對照實施例2利用商品化TRizol試劑提取美人蕉葉組織的總RNA取0.1美人蕉葉組織，經液氮研磨後，加入1ml Trizol充分研磨，之後加入0.2ml氯仿混勻，12000rpm離心5min，取上清，加入等體積的異丙醇沉澱，最後，用50ul DEPC H2O溶解沉澱。取5ul核酸樣品進行甲醛變性瓊脂糖膠電泳檢測。結果，多次採用這一方法提取的核酸產率極低，有的次數無法檢測到核酸條帶。
以上實驗證明使用本發明的方法能實現從微量組織中提取病毒核酸的目的，而現有方法則不行。
最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法，其特徵是依次包括以下步驟1)、將被病毒侵染的植物寄主組織，按照0.05-0.2克/100μl的比例在預冷的病毒粒子保護性緩衝溶液中研磨至勻漿，所述病毒粒子保護性緩衝溶液的pH值為5.0～9.0；2)、將上述勻漿轉移到0.2-1.5ml的塑料離心管中，室溫下靜止10～20分鐘，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；用弱鹼性緩衝溶液洗所述塑料離心管壁2～4次，洗滌完畢後，離心後吸除殘液；3)、加入焦碳酸二乙酯處理的去離子水，升溫至70℃～100℃，保溫1～3分鐘，使病毒粒子解離，釋放出病毒核酸。
2.根據權利要求1所述的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法，其特徵是將所製備的病毒核酸直接用於RT-PCR或低溫方式保存；或先將病毒核酸稀釋至9～10倍的體積，並加入與稀釋後病毒核酸體積比為2/3～1倍的異丙醇或體積比為3～4倍的酒精，沉澱獲得純化濃縮的病毒核酸。
3.根據權利要求1或2所述的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法，其特徵是步驟2)中，將所述勻漿轉移到塑料離心管中，先將塑料離心管低速離心或者振蕩後，再室溫下靜止10～20分鐘。
4.根據權利要求3所述的從植物微量組織中提取病毒核酸的方法，其特徵是步驟1)中，所述病毒粒子保護性緩衝溶液的濃度為0.01～1.0mol/L；步驟2)中，每次使用100-200μl弱鹼性緩衝溶液洗塑料離心管壁；步驟3)中，加入8μl～20μl的焦碳酸二乙酯處理的去離子水。
5.根據權利要求4所述的從植物微量組織中提取病毒核酸的方法，其特徵是所述步驟1)中的病毒粒子保護性緩衝溶液是pH值為5.0～9.0的磷酸緩衝液、硼酸緩衝液、或PBST溶液。
6.根據權利要求5所述的從植物微量組織中提取病毒核酸的方法，其特徵是所述步驟2)中的弱鹼性緩衝溶液為PBST溶液。
7.根據權利要求6所述的從植物微量組織中提取病毒核酸的方法，其特徵是所述步驟1)中的病毒粒子保護性緩衝溶液是pH7.2的PBST溶液。
8.根據權利要求7所述的從植物微量組織中提取病毒核酸的方法，其特徵是所述步驟2)中的塑料離心管為0.5-1.5ml的聚丙烯離心管、聚苯烯離心管、聚四氟離心管。
9.根據權利要求8所述的從植物微量組織中提取病毒核酸的方法，其特徵是所述步驟2)中的塑料離心管為0.5-1.5ml的不進行矽烷化處理的聚丙烯離心管。
全文摘要
本發明公開了一種從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法，依次包括以下步驟1)將被病毒侵染的植物寄主組織，按照0.05－0.2克/100μl的比例在預冷的病毒粒子保護性緩衝溶液中研磨至勻漿，病毒粒子保護性緩衝溶液的pH值為5.0～9.0；2)將上述勻漿轉移到0.2－1.5ml的塑料離心管中，室溫下靜止10～20分鐘，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；用弱鹼性緩衝溶液洗塑料離心管壁2～4次，洗滌完畢後，離心後吸除殘液；3)加入焦碳酸二乙酯處理的去離子水，升溫至70℃～100℃，保溫1～3分鐘，使病毒粒子解離，釋放出病毒核酸。本發明的方法，僅需微量樣品就能進行RNA病毒核酸分離，因此成本低廉、操作簡便。
文檔編號C07H21/02GK1763063SQ20051006093
公開日2006年4月26日 申請日期2005年9月28日 優先權日2005年9月28日
發明者陳集雙, 杜志遊, 竺錫武, 王鐠, 陳紹寧 申請人:浙江理工大學