溶菌酶脂質體及其製備方法
2023-07-03 09:39:46
專利名稱：溶菌酶脂質體及其製備方法
技術領域：
本發明屬藥物製劑領域，具體涉及一種溶菌酶脂質體及其製備方法。
背景技術：
溶菌酶又稱胞壁質酶或N一乙酸胞壁質聚糖水解酶，廣泛應用於醫學臨床，具有多種藥理作用。由於它能水解細菌胞壁，在細胞內對吞噬後的病原菌起破壞作用，可用於抗感染、消炎、消腫、增強體內免疫反應等；它能分解稠厚的粘蛋白，排出膿性創滲出物，可用於清除壞死組織，加速創口的修復再生；與抗菌素合用對五官科多種黏膜疾病的治療有增效作用。此外，還有凝血、止血作用。
國內外有很多關於溶菌酶的醫學應用的專利申請。專利CN01107864.2公開了一種以溶菌酶為主要成分的外用凝膠劑及製備方法，用於消炎殺菌、清潔陰道、消除瘙癢、清除異味，有效率達81.58％；專利CN200410020814.8公開了溶菌酶泡騰片製法及其應用；專利CN200410020817.1公開了溶菌酶膜劑的製法及其應用，製備工藝簡單，安全無毒副作用，有很好的藥用前景；專利CN200410020816.7涉及溶菌酶在製藥領域的新用途，涉及在製備治療由細菌、真菌、病毒、變態反應、職業性、物理性、神經功能障礙性、免疫性引起的皮膚病變、感染、潰爛疾病的藥物中的應用。專利WO 0204011公開了一種合成一種含有多個胺基酸鏈的溶菌酶多聚體來治療腫瘤、愛滋病等；專利WO 0200247公開了一種利用溶菌酶二聚體來破壞微生物對抗生素的抗藥性，恢復抗菌素的殺菌性能。
脂質體作為新型藥物載體，具有靶向性和長效緩釋作用，在醫藥學上有著極大的發展前景，但目前國內外尚未見溶菌酶脂質體的研究報導。
發明內容
本發明的目的是公開一種溶菌酶脂質體及其製備方法，以提高溶菌酶的藥物利用性，同時賦予新劑型緩釋性能和一定的靶向作用。
本發明由溶菌酶，磷脂和親脂性穩定劑製備成溶菌酶脂質體。本發明的製備方法是，先將磷脂和親脂型穩定劑溶於一定密度的有機溶劑中，完全溶解後加入一定濃度的溶菌酶溶液，超聲分散成穩定的乳液後減壓蒸乾有機溶劑，並加入緩衝溶液水合2～3小時，製得溶菌酶脂質體。
本發明所述的磷脂是卵磷脂。
本發明選用親脂性穩定劑穩定脂質體結構，減少藥物的洩漏、變質。所述穩定劑包括，膽固醇，硬脂胺，磷脂酸，生育酚，維生素E。
本發明的磷脂和親脂性穩定劑的質量比為1∶1～7∶1；溶菌酶和磷脂與親脂性穩定劑總質量的質量比為0.013∶1～0.0044∶1。
本發明所用的水相介質是根據中國藥典2000版標準製備的磷酸鹽緩衝溶液，pH值6.5～7.4。
本發明中水相介質和有機溶劑的體積比為0.5∶1～3∶1。
採用本發明方法獲得的溶菌酶脂質體包封率可達84％以上，製備工藝重現性好。脂質體的粒徑不大於500nm，在體外具有良好的緩釋性，殺菌效果顯著。
圖1為溶菌酶脂質體電鏡照片，放大12000倍。
圖2為溶菌酶脂質體電鏡照片，放大50000倍。
圖3為溶菌酶脂質體粒徑分布照片。
圖4溶菌酶溶液及溶菌酶脂質體累積釋放曲線。
具體實施例方式
通過下面實施例說明本發明的具體實施方式
，但本發明的保護範圍，不局限於此。
實施例1將卵磷脂0.60g和膽固醇0.30g充分溶於12ml用乙醚和氯仿混合調成的密度為1g/ml的混合溶劑，完全溶解後加入2mg/ml的溶菌酶溶液4ml，以超聲5秒停5秒的強度冷水浴超聲180s，減壓蒸乾有機溶劑使原料成均勻膜。加入30mlpH為6.8的PBS溶解膜狀物，所得懸液水浴條件下繼續水合3小時，製得溶菌酶脂質體，其包封率如表1所示。
表1溶菌酶脂質體的包封率
(1)包封率測定稱取一定量的產物，按其佔總產物的比例計算其中所含溶菌酶的量作為M總。取適量的溶菌酶脂質體樣品裝入預先用PBS浸泡24h的透析袋中，並將其浸入30ml PBS中透析24h後於294nm處測定透析液的吸光度，按溶菌酶標準曲線(實驗測得為A＝7.6857c-0.0152(R＝0.9999，n＝5))計算其所對應的溶菌酶的量作為M遊。按包封率EN％＝(M總-M遊)×100％/M總，算得產物的包封率為84.9％。
(2)形態學觀察形態觀察適量產物以PBS稀釋20倍後，滴於銅網上放置至成膜均勻，多餘液體揮幹，透射電鏡下觀察，所得為大單室脂質體，呈球形，外觀圓整，外圈為包含溶菌酶的脂層，厚而均一連續，脂質體顆粒間彼此分散，獨立。見圖1、圖2。
粒徑分布測定取2g產物以PBS稀釋50倍測定體積粒徑分布，如圖3所示，所得產物的粒徑範圍為150～350nm，分布較為均勻。
實施例2體外釋放測定取0.95mg溶菌酶、含0.95mg溶菌酶的脂質體及空白脂質體，置於Franz擴散池供應室中，接受室中裝PBS接受液，(37±1)℃恆溫水浴恆速攪拌(120r/min)，不同時間取樣，同時補加同溫同體積新鮮釋放介質。每個時間點溶菌酶的UV值以接收液的UV值作校正，溶菌酶脂質體的UV值用相應時間點的空白脂質體的UV值作校正，同一樣品取3次，計算實驗平均值。按公式Qn＝Cn+∑Cn-1計算累積釋藥量Qn(C為根據標準曲線計算所得的藥物濃度，n為取樣次數)。以累積釋藥百分率對時間作圖得圖4。
結果表明，溶菌酶溶液釋放速度較快，6h時累積釋放率就達到95.6％，6h後趨於平衡。而6h時脂質體中溶菌酶的釋放率僅為33.1％，18h時才趨於平衡，說明溶菌酶脂質體在體外具有明顯的緩釋效果。
實施例3殺菌實驗採用營養肉湯稀釋法。
取2ml溶菌酶脂質體，以營養肉湯培養基稀釋至10ml，依次取適量，以營養肉湯培養基稀釋，使溶菌酶的活性濃度分別為0.5個活性單位、1個活性單位/ml、2個活性單位/ml、3個活性單位/ml，4個活性單位/ml。實驗菌種為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。
結果，上述活性單位濃度的溶菌酶脂質體下均未見菌種生長。溶菌酶脂質體殺菌效果顯著。
權利要求
1.一種溶菌酶的脂質體及其製備方法，其特徵在於將磷脂和親脂型穩定劑溶於一定密度的有機溶劑中，完全溶解後加入一定濃度的溶菌酶溶液，超聲分散成穩定的乳液後減壓蒸乾有機溶劑，並加入緩衝溶液水合2～3小時，製得溶菌酶脂質體。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述磷脂是卵磷脂。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的親脂性穩定劑包括，膽固醇，硬脂胺，磷脂酸，生育酚，維生素E。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，磷脂和親脂性穩定劑的質量比為1∶1～7∶1。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，溶菌酶的質量與磷脂和親脂性穩定劑二者總質量的質量比，即藥脂質量比，為0.013∶1～0.0044∶1。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的有機溶劑為不同體積比的乙醚和氯仿的混合液。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，水相介質是pH為6.5～7.4的磷酸鹽緩衝溶液。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，水相介質和有機溶劑的體積比為0.5∶1～3∶1。
全文摘要
本發明涉及一種含溶菌酶的脂質體及其製備方法。本發明由溶菌酶，磷脂和親脂性穩定劑製備成溶菌酶脂質體。其方法是先將磷脂和親脂型穩定劑溶於一定密度的有機溶劑中，完全溶解後加入一定濃度的溶菌酶溶液，超聲分散成穩定的乳液後減壓蒸乾有機溶劑，並加入緩衝溶液水合而成。本發明製備工藝重現性好，溶菌酶脂質體包封率可達84％以上；產物形態圓整，粒徑均一，緩釋性能優，殺菌效果顯著。
文檔編號A61P17/00GK1840184SQ20061002355
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月23日 優先權日2006年1月23日
發明者徐雲龍, 錢秀珍, 徐盛, 儲小衛 申請人:上海微納科技有限公司