一種分離純化β-葡萄糖苷酶的方法

2023-05-26 07:54:51

專利名稱：一種分離純化β-葡萄糖苷酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離純化P-葡萄糖苷酶的新方法，具體涉及一種以微晶纖維素作為親和柱層析介質，利用酶與底物的特異性吸附，高效純化e-葡萄糖苷酶的方法。技術背景P-葡萄糖苷酶(EC3.2. 1.21)，也稱P-D-葡萄糖苷酶，它能夠水解結合於末端非還原性的e-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出葡萄糖和相應的配基。葡萄糖 苷酶存在於自然界許多植物、昆蟲、酵母、黴菌及細菌體內，它參與生物體的糖 代謝，對維持生物體正常生理功能起著重要作用。在食品工業中，常用e-葡萄 糖苷酶來改善飲料、果酒及茶葉等的風味，其機理是將某些風味前體物質水解為 具有濃鬱天然風味的香氣物質。在醫藥工業中，則利用e-葡萄糖苷酶的生物轉 化功能，將某些廣泛存在的天然產物轉化為在自然界稀有甚至不存在的藥物。如 有研究利用特定的人參皂苷e -葡萄糖苷酶，能夠將在人參中含量豐富的人參皂苷Rbl轉化為具有抗腫瘤活性的Rg3、 Rh2或CK等。因此，0 -葡萄糖苷酶是一類極 其重要的酶。然而，目前該類酶的分離純化過程仍局限一般的蛋白純化過程，拘 泥於多種傳統柱色譜的組合應用，如離子交換柱、疏水柱和分子篩柱等，純化步 驟複雜且成本高，這已成為制約有關科學研究及其工業應用的瓶頸問題。因此， 建立一種高效經濟的純化方法是3 -葡萄糖苷酶研究及應用過程中一個迫切需要 解決的重要問題。微晶纖維素為天然纖維素經稀酸水解並經一系列處理後得到的極限聚合度 的產物，它是一種無臭、無味、極細微的白色短棒狀或無定形結晶粉末，廣泛應 用於醫藥、食品、化妝品、化工、農業等各生產領域。微晶纖維素可作為健康食 品的食用纖維，具有加強腸道蠕動，預防動脈硬化和吸附腸內毒素等功能；微晶 纖維素在冷凍食品中充當物理性阻礙物，防止晶粒聚集在一起成為大的晶體；將 微晶纖維素加在酸奶酪中可以一定程度避免乳清分離的現象，保證製品的穩定 性。在醫藥領域內，微晶纖維素常常被用作藥品生產中的賦型劑和緩釋劑。然而，
至今為止，未見有利用微晶纖維素來分離純化e -葡萄糖苷酶的報導。 發明內容本發明的目的是提供一種新的分離純化p -葡萄糖苷酶的方法，該方法高效 而經濟。本方法以微晶纖維素作為e -葡萄糖苷酶的親和柱層析介質，在低溫和微酸 性條件下，將e-葡萄糖苷酶上樣並特異性吸附於微晶纖維素柱，然後通過增加 Naci濃度的方法將該酶洗脫，實現高效並經濟的分離純化e -葡萄糖苷酶。微晶纖維素為葡萄糖的聚合體，作為的天然酶解底物，它在低溫和微酸性條 件下能特異性的吸附p -葡萄糖苷酶，而這種吸附在高離子濃度條件下可以被解 析。本發明微晶纖維素的特性，採用微晶纖維素作為e-葡萄糖苷酶的親和柱層 析介質，用於該類酶的高效純化，具有成本低和純化效率高的優點。本發明方法包括下述步驟1、 製備微晶纖維素層析柱將微晶纖維素(市購商品化產品)經過表面活性洗滌劑處理，再用蒸餾水徹底衝洗乾淨，除去其本身帶有的雜質，然後裝柱，用不含NaCl的微酸性緩衝液充 分平衡；2、 分離純化P-葡萄糖苷酶用於分離純化的粗酶液先在平衡緩衝液中透析， 然後上樣於已平衡好的微晶纖維素柱，用平衡緩衝液洗脫後，逐步增加緩衝液中 的NaCl濃度，至目標P-葡萄糖苷酶被洗脫下來；3、 產品純度鑑定按常規方法收集具P -葡萄糖苷酶活性的部分，在SDS-PAGE 蛋白膠上鑑定蛋白純度。本發明方法在低溫(0-l(TC)下進行，優選溫度為4-6'C。 本發明方法使用過的微晶纖維素柱， 一般直接採用高濃度(0.8-1.0 M)的 NaCl溶液清洗後可重複使用；或用表面活性洗滌劑處理並用蒸餾水衝洗及高濃度 (0.8-1.0 M)的NaCl溶液清洗柱子後，重複使用。本發明方法中，所採用的微晶纖維素在低溫和微酸性條件下，能特異性的吸 附0-葡萄糖苷酶，同時可能非特異性的吸附其它雜蛋白。所述的非特異性吸附 的雜蛋白在較低的NaCl濃度下能很容易的被洗脫，而特異性吸附的e -葡萄糖苷 酶則需要較高濃度的NaCl溶液條件下才能被洗脫。因此，微晶纖維素作為親和
層析介質，在分離純化3 -葡萄糖苷酶時具有分離過程簡單和純化效率高的優點。 與現有技術的柱層析方法相比，本方法分離純化P -葡萄糖苷酶純化效率高， 成本低廉。突出體現在由於酶和底物的吸附具有選擇性高的特點，所以純化效 率比一般的蛋白分離層析方法要高得多；同時，所採用的微晶纖維素是一種極經 濟易得的工業化材料，因此操作成本十分低廉。


圖i是實施例2的e-葡萄糖苷酶I的純化結果，其中，1:菌體破壁，2: 90%飽和(NH》2S(V沉澱， 3: Q-S印harose FF洗脫Peak I ， 4:微晶纖維素柱0.2M NaCl洗脫， 5:蛋白分子量標準。 圖2是實施例3的e-葡萄糖苷酶II的純化結果，其中，1:菌體破壁，2: 90%飽和(NH丄S04沉澱，3: Q-S印harose FF洗脫Peak III,4:微晶纖維素柱0.2M NaCl洗脫，5:蛋白分子量標準。 圖3是實施例3中採用現有方法純化e -葡萄糖苷酶II的結果，其中，1:菌體破壁，2: 90%飽和(NH》2S04沉澱，3: Q-S印harose FF洗脫Peak III，4: phenyl-sepharose CL-4B洗脫，5: CHT ceramic hydroxyapatite洗脫，6: sephacryl S-300 HR洗脫，7:蛋白分子量標準品。
具體實施例方式
實施例l製備微晶纖維素親和層析柱稱取15-20g微晶纖維素粉末(上海恆信化學試劑有限公司)，懸浮於200ral 含表面活性洗滌劑的水溶液中，置於磁力攪拌器上攪拌1-2 h，靜止片刻，棄去 懸浮雜質，用蒸餾水充分衝洗乾淨，然後懸浮於200 ml醋酸緩衝液(pH 4.0， 0.01M)，置於4-6'C環境中裝柱，以相同的緩衝液徹底平衡柱子，待用。實施例2分離純化e-葡萄糖苷酶I分離純化過程在4-6'c環境下進行。採用含有多種e -葡萄糖苷酶的擬青黴菌sp.229 (中國專利申請號:200410018000.0，
發明者欽 嚴, 馮美卿, 偉 周, 珮 周, 李幸慰 申請人:復旦大學