傳染性胰腺壞死重組vp2蛋白抗原及純化方法

2023-05-26 17:42:11

專利名稱：傳染性胰腺壞死重組vp2蛋白抗原及純化方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物製劑，本發明還涉及這種生物製劑的製備方法。具體地說是一種魚傳染性胰 腺壞死重組VP2蛋白抗原及製備方法。
(二)
背景技術：
傳染性胰腺壞死是由傳染性胰腺壞死病病毒(Infectious pancreas necrosis vims, IPNV)引起鮭科魚類 的一種高度傳染性和急性病毒性疾病，典型症狀為遊動異常，病魚體色深暗，腹部膨脹，眼球突出，皮下、 肝胰腺等內臟實質器官出血壞死，高致病力毒株對兩月齡的幼魚致死率高達恥％，感染後倖存的魚終生帶 毒，通過糞便和精卵排出病原，成為潛在的傳染源。因該病流行範圍廣，發病和致死率高，給我國和世界 各國鮭鱒養殖業帶來重大的經濟損失。
傳染性胰腺壞死的傳統診斷方法常根據流行病學和主要症狀表現作為初步診斷的依據。但由於傳染性 造血組織壞死病毒和艾特韋病毒也能引起皮下出血和內臟器官出血壞死，在流行病學和症狀上很難區別， 因此必須依靠病毒分離和血清學實驗才能最後確診。
自從1960年Wolf首次報導了鮭鱒幼魚傳染性胰腺壞死以來，世界各國對IPNV.診斷技術進行了大量 研究，已建立了病毒分離(Isolation of Virus IV)、螢光抗體技術(Fluorescent An他ody Test FAT)、病毒 中和試驗(Virus Neutralization VN)、酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)和 多聚酶鏈式反應(Poly Chain Reaction PCR)等方法。根據流行病學、主要症狀和病理變化可對IPN進行 初步診斷，若與魚的傳染性造血組織壞死和艾特韋病毒引起的病毒性出血敗血症相區分，還需在實驗室確 診。
快速準確的疫病診斷是防治傳染性胰腺壞死的重要前提。而目前還沒有行之有效的防治方法。在診斷 和檢測上對可疑病料進行病毒分離與鑑定是此病最為直觀的診斷方法，但是分離病毒需要一定的條件和相 當常的時間，因此，此種診斷方法存在費時、費力不能快速診斷的弊端；本病快速診斷方法最常應用的是 血清學試驗、螢光抗體試驗和酶聯免疫吸附試驗等。而血清學方法診斷的準確性依賴於診斷抗原及抗體的 特異性。

發明內容
本發明的目的在於提供一種可以克服傳染性胰腺壞死傳統診斷抗原所存在的排毒、散毒的潛在危險， 可作為一種疾病檢測的診斷抗原的傳染性胰腺壞死重組VP2蛋白抗原；本發明的目的還在於提供一種傳染 性胰腺壞死重組VP2蛋白抗原的純化方法。
本發明的內容是從IPNV病毒液中進行病毒核酸(RNA)提取，以IPNV VP2基因的下遊引物P2進行病 毒基因組cDNA的合成，再利用IPNVVP2基因的上、下遊引物，進行VP2基因的擴增，將擴增得到的IPNV VP2基因克隆到原核表達載體質粒pET30b中，並在大腸桿菌BL21菌株中進行表達得到傳染性胰腺壞死重 組VP2蛋白抗原，其命名為pET30b-IPNV VP2/ BL21 (Escherichia coli BL21 a w他recombinant plasmid of Infectious pancreas necrosis virus VP2 gene)。它是保藏在中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC NO: M209002,保藏日期2009年1月6日。
IPNV VP2基因cDNA序列為GCTATGGCAAGTACGACCCCGAA 上、下遊引物序列分別
PI 5 'Ggatcc a GAGCGACACATCTTAAAACAAGAGAC 3' P2 5' CtcgagTTCGGGGTCGTACTTGCCATAG 3'。
本發明的傳染性胰腺壞死重組VP2蛋白抗原的純化方法
1. 融合蛋白的大量表達
(1) 將PET30b-IPNV VP2/ BL21接種於10mL含有Kana'LB培養基中，37。C振蕩培養過夜；
(2) 按1:50轉接2raL過夜培養物於100 mL含100 u g/mL的Kana^B培養液中，於37。C振蕩培養4 h 左右,0D6oo值達到0.6時，取出l mL樣品供電泳分析。
(3) 加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，於37。C繼續培養至0D6。。值達到1. 0時終止培養，取出1 mL樣 品供電泳分析。
2. 融合蛋白的純化
(1) 向1.5cmX7.5cm層析柱中加入lmlNi、NTA凝膠介質，20ml去離子水洗柱後，再用20mlBuffer A溶液洗柱。
(2) 將100ml菌液經8000 rpm離心20min，去上清，沉澱的菌體用10ml冷的菌體裂解液I快速懸起， 加溶菌酶(10mg/ml) 10ul混勻,冰浴30min，超生裂解30min。
(3) 4'C條件下，以8000rpm離心10min，棄上清；
(4) 將菌體沉澱用預冷15ml緩衝液II重新懸起，4'C, 8000rpm,離心10min,棄上清，重複4次， 所得沉澱即為粗提包涵體；
(5) 用8ml緩衝液ni溶解包涵體，4'C條件下，以12000rpm離心20min，棄上清；
(6) 用4ml PBS懸起包涵體沉澱混勻，以0.5ml/min的流速加入到Ni"-NTA柱中；收集流出液再依 次使用20ralBuffer A、 20mlBuffer B以0. 5ml/min的流速洗滌後收集流出液，SDS-PAGE電泳分析；
(7) 用含有80imnol/L咪唑的Buffer C 10ml進行洗滌，收集洗脫液，檢測蛋白濃度，保存含有重組 蛋白的洗脫液，短期保存在4'C下保存，長期保存於-2(TC下保存。
隨著現代分子免疫學和分子生物學等先進技術的開發利用，為新一代生物工程診斷試劑的研製開發 開闢了新途徑。以基因工程、細胞工程等先進的技術手段獲得的診斷抗原或抗體，其突出特點在於均一性 好，純度高，特異性強、性能穩定，並易於保存和批量生產，由此建立診斷技術和方法易於國際標準化， 是未來疫病診斷髮展的主要方向。同時，以生物技術生產的診斷抗原，可避免煩瑣的細胞培養來製備大量 的抗原物質。
IPNV VP2蛋白含有病毒的主要抗原表位和中和抗體表位，分子質量為54kDa,是IPNV的主要衣殼蛋 白，佔病毒粒子蛋白的62%,含有病毒主要抗原決定簇，由150個胺基酸多肽構成，並且這個多肽攜帶了 抗原決定簇，含有特異性抗原表位，能夠誘導病毒中和抗體，能夠激發較強的免疫應答，因此對外衣殼蛋 白VP2基因的進行克隆、表達及其表達產物純化。其純化的蛋白產物，無論是作為一種疾病的診斷抗原， 還是作為一種激發機體免疫應答的免疫製劑，均是極為有用的新型生物製劑。該製劑的進一步應用，將對 IPN的診斷與防治提供重要的物質基礎。IPNV的檢測和IPN早期準確的診斷在防治該病的流行上具有重要 作用，因此進一步完善這些檢測方法，使之具有高度的特異性、敏感性，更加快速、簡便，更適用於常規 大量樣品的檢測，將具有更重要的實際意義。利用分子生物學技術製備的重組IPNV VP2蛋白具有與天然的VP2蛋白相近的免疫生物學技術特性， 而且可以規模化生產，該項技術避免採取體外培養病毒抗原、差速離心和密度梯度離心純化病毒的生產方 法，提高了工作效率，減少了非特異性反應。以此法生產的抗原，可避免以活病毒做抗原散播病毒的危險。
(四)


圖1傳染性胰腺壞死病毒VP2基因的RT-PCR擴增結果凝膠電泳圖 l.DNA MarkerDL2000: 2. VP2基因PCR擴增產物(1095 bp) 圖2重組質粒pMD18-T-VP2酶切、PCR鑑定結果
1. DNA Marker DL15000; 2. B柳HI單酶切；3. J力ol單酶切；4. 5a威I和雙酶切；5. DNA MarkerDL2000; 6. PCR鑑定結果7. PCR陰性對照. 圖3重組質粒PET30b-IPNV VP2酶切、PCR鑑定結果
1. DNA Marker DL15000; 2. BamHI單酶切；3. 單酶切；4.飽/zH I和雙酶切；5. DNA
MarkerDL2000: 6. PCR鑑定結果；7. PCR陰性對照.
圖4重組大腸桿菌pET30b-IPNV VP2/ BL21表達VP2蛋白SDS-PAGE及Western-blotting鑑定結果 重組菌pET30b-IPNV VP2/ BL21誘導表達的SDS-PAGE鑑定結果丄protein marker (116kD 14. 4kD); 2. pET30b-IPNV VP2/ BL21未經IPGT誘導3. pET30b-IPNV VP2/ BL21經IPGT誘導 目的蛋白Western-blot鑑定結果.將蛋白轉印NC膜，先後與兔抗IPNV血清和HRP標記羊抗兔IgG 作用，顯色後觀察結果4. protein marker (U6kD 14. 4kD) ;5. pET30b-證VP2/BL21未經IPGT 誘導Western blot結果未出現預期的反應帶；6. pET30b-IPNV VP2/ BL21經IPGT誘導Western blot鑑定 出現預期大小的免疫反應帶。
圖5融合蛋白純化的SDS-PAGE電泳圖和Western-blotting圖譜
重組菌pET30b-IPNV VP2/ BL21誘導表達的SDS-PAGE鑑定結果.1 2..經親和層析純化的菌體蛋白；3 pET30b-IPNV VP2/ BL21經IPGT誘導後超聲裂解沉澱;4. pET30b-IPNV VP2/ BL21經IPGT誘導後超聲裂 解的上清；5. protein marker (116kD 14. 4kD)
目的蛋白Western-blot鑑定結果.將蛋白轉印NC膜，先後與兔抗IPNV血清和HRP標記羊抗兔IgG
作用，顯色後觀察結果6. pET30b-IPNV VP2/BL21未經IPGT誘導Western blot結果未出現預期的
反應帶；7. pET30b-IPNV VP2/ BL21經IPGT誘導經親和層析純化的菌體蛋白Western blot鑑定出現預
期大小的免疫反應帶。
圖6發明產品的具體製作工藝流程圖
(五)
具體實施例方式
從繁殖IPNV病毒的細胞培養液中進行病毒核酸(RNA)提取，以IPNV VP2基因的下遊引物P2進行病 毒基因組cDNA的合成，再使用IPNVVP2基因的上、下遊引物，進行VP2基因的擴增，將擴增後的IPNVVP2 基因克隆到原核表達載體質粒pET30b中，並在大腸桿菌BL21菌株中進行表達，根據載體的特點，本實驗 選用IPTG誘導融合蛋白的表達，表達產物在經SDS-PAGE分析和免疫印記(Western-blot)檢測抗原活性 之後，融合蛋白的純化利用原核表達載體pET30b所表達的重組蛋白帶有6個連續組氨酸殘基，可結合在 Ni-NTA柱上，又因咪唑可競爭地結合在Ni-NTA柱上而將重組蛋白置換下來，為重組融合蛋白的提取純化 提供了一種有效方法。
權利要求
1.一種傳染性胰腺壞死重組VP2蛋白抗原，其特徵是它是從傳染性胰腺壞病毒細胞培養液中進行病毒核酸(RNA)提取，以IPNV VP2基因的下遊引物P2進行病毒基因組cDNA的合成，再利用IPNV VP2基因的上、下遊引物，進行VP2基因的擴增，將擴增得到的IPNV VP2基因克隆到原核表達載體質粒pET30b中，並在大腸桿菌BL21菌株中進行表達得到傳染性胰腺壞死重組VP2蛋白抗原。
2. 根據權利要求1所述的傳染性胰腺壞死重組VP2蛋白抗原，其特徵是VP2蛋白基因序列為GCTATGGCAAGTACGACCCCGAA引物序列為Pl 5 'GgatecaGAGCGACACATCTTAAAACAAGAGAC 3'，P2 5' CtcgagTTCGGGGTCGTACTTGCCATAG 3'。
3. —種傳染性胰腺壞死重組VP2蛋白抗原的純化方法，其特徵是融合蛋白的大量表達(1) 將PET30b-IPNV VP2/ BL21接種於10mL含有Kana'LB培養基中，37。C振蕩培養過夜；(2) 按1:50轉接2mL過夜培養物於100 mL含100 w g/mL的Kana'LB培養液中，於37'C振蕩培養4 h 左右,ODeo。值達到0. 6時，取出1 mL樣品供電泳分析。(3) 加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,於37'C繼續培養至00600值達到1. 0時終止培養，取出1 mL樣 品供電泳分析。融合蛋白的純化(1) 向L5cmX7.5cm層析柱中加入lralNi2+-NTA凝膠介質，20ml去離子水洗柱後，再用20mlBuffer A溶液洗柱。(2) 將100ml菌液經8000 rpm離心20min，去上清，沉澱的菌體用10ml冷的菌體裂解液I快速懸起， 加溶菌酶(10mg/ml) 10ul混勻,冰浴30min,超生裂解30min。(3) 4。C條件下，以8000rpm離心10min,棄上清;(4) 將菌體沉澱用預冷15ml緩衝液II重新懸起，4'C, 8000rpm，離心lOmin，棄上清，重複4次，所得沉澱即為粗提包涵體；(5) 用8ml緩衝液ni溶解包涵體，4'C條件下，以12000rpm離心20min，棄上清；(6) 用4ml PBS懸起包涵體沉澱混勻，以0.5ml/min的流速加入到Ni、NTA柱中；收集流出液再依 次使用20mlBuffer A、 20mlBuffer B以0. 5ml/min的流速洗滌後收集流出液，SDS-PAGE電泳分析；(7) 用含有80ramol/L咪唑的Buffer C 10ml進行洗滌，收集洗脫液，檢測蛋白濃度，保存含有重組 蛋白的洗脫液，短期保存在4'C下保存，長期保存於-20'C下保存。
全文摘要
本發明提供的是一種傳染性胰腺壞死重組VP2蛋白抗原及純化方法。從傳染性胰腺壞病毒細胞培養液中進行病毒核酸(RNA)提取，以IPNV VP2基因的下遊引物P2進行病毒基因組cDNA的合成，再利用IPNV VP2基因的上、下遊引物，進行VP2基因的擴增，將擴增得到的IPNV VP2基因克隆到原核表達載體質粒pET30b中，並在大腸桿菌BL21菌株中進行表達得到傳染性胰腺壞死重組VP2蛋白抗原。該抗原可以克服傳染性胰腺壞死傳統診斷方法中的抗原所存在的排毒、散毒的潛在危險，可作為一種疾病監測的診斷抗原。
文檔編號C07K14/005GK101580541SQ20091007126
公開日2009年11月18日 申請日期2009年1月14日 優先權日2009年1月14日
發明者喬薪瑗, 敏 劉, 唐麗傑, 李一經, 葛俊偉 申請人:東北農業大學