一種高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的設備及方法與流程
2023-05-26 13:39:32
本發明涉及生物
技術領域：
，具體而言，涉及一種高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的設備及方法。
背景技術：
：循環腫瘤細胞(CTC，CirculatingTumorCell)是存在於外周血中的各類腫瘤細胞的統稱。在腫瘤的發展過程中，因自發或診療操作從實體腫瘤病灶(原發灶、轉移灶)脫落，大部分CTC在進入外周血後發生凋亡或被吞噬，少數能夠逃逸並錨著發展成為轉移灶，增加惡性腫瘤患者死亡風險，在腫瘤的侵襲轉移中起著重要作用。循環腫瘤細胞脫落進入循環系統中，許多研究結果已經證實其在腫瘤轉移的診斷和預後、藥物研發、個體化治療及其探索腫瘤轉移機制等方面具有潛在的價值。因此，特異、敏感地檢測循環腫瘤細胞非常重要，不僅能夠更加準確地評估腫瘤患者的預後，還有利於制定個性化治療方案。根據腫瘤細胞轉移的途徑，在血液或淋巴管中循環的腫瘤細胞被定義為循環腫瘤細胞(circulatingtumorcell，CTC)，而其中若干細胞聚集形成的細胞團塊被稱為循環腫瘤微栓(circulatingtumormocroemboli,CTM)。CTM是腫瘤細胞的「集體遷移」行為，因其能夠抵抗細胞凋亡、保持細胞增殖能力而具有更高的轉移潛能。然而，外周血中循環腫瘤細胞的數目較少(1個CTC/106～107個單核細胞)，精確分離很困難。CellSearch系統是目前FDA唯一批准用於臨床富集及檢測分析的技術設備，是一種半自動技術，集合了免疫磁珠分選技術和免疫細胞化學法的分離檢測技術。標記有抗EpCAM抗體的磁珠與靶細胞結合，在外加磁場作用下被保留下來，接著採用螢光標記(CK8/18/19，DAPI，CD45)來區別CTC與血細胞，隨後採用半自動螢光顯微鏡檢測分析細胞大小和形態，最終確定CTC。但是，該法操作複雜，成本很高，通量低，限制了其在臨床大規模篩選檢測時的應用。另外，由於外周血中存在一定數量的非腫瘤性上皮細胞(循環上皮細胞)，加上大多數惡性循環腫瘤細胞由於上皮-間質轉變，從而丟失了上皮抗原EpCAM，因而無法被檢測到。因此當CTC計數用於評估腫瘤對治療的反應、腫瘤復發風險以及腫瘤篩查時，這些問題就顯得特別重要。此外，由於多步細胞標記和處理會使細胞團塊離散，從而使得免疫磁性分離法無法用來檢測轉移風險更高的CTM。另外一種CTC富集方法採用密度梯度分離原理，根據血液中的各種細胞的密度不同，利用一種特定密度且近於等滲的溶液(分層液)與標本加入同一試管後離心，使一定密度的細胞按相應密度梯度分布，從而將血液中各種細胞加以分離。分離後可以進行細胞染色、免疫標記等進一步的分析。在此基礎上建立起來的OncoQuick方法(德國Greiner公司)，用一種專用的50mL的試管，內置多孔屏障，其下為密度梯度分離液，使用時將標本置於屏障之上從而避免在離心之前與分離液混合，與前相比(CellSearch系統)，更易從粒細胞中分離出腫瘤細胞，從而更有利於進一步的分析。該法的局限性在於由於部分腫瘤細胞可遷至血漿層或留於紅細胞或中性粒細胞中，不僅容易造成在分離過程中腫瘤細胞的丟失，而且如果血液抗凝不完全，微小凝塊則可能使腫瘤細胞落至梯度密度液的底部。因此該法敏感性較低且依賴於腫瘤細胞的特性、離心的時間、溫度等多種因素。2000年Vona等報導了一種依據細胞大小，通過過濾直接富集上皮性腫瘤細胞的方法(isolationbysizeofepithelialtumorcells,ISET)。該法可使較小的淋巴細胞和中性粒細胞通過，而較大的腫瘤細胞則被阻滯在膜上。該方法不僅操作簡單，而且比較敏感，可避免煩瑣的多步驟分離造成的稀少細胞的破壞和丟失，且具有高轉移潛能的CTM也能被富集和計數。富集到的細胞可進行細胞學染色，或通過免疫標記、螢光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)、TUNEL等方法分析其抗原、非整倍性和細胞凋亡等。但是，目前該法多採用實驗室手動操作，自動化程度低，通量低，誤差大，且容易引起交叉汙染，特別易於在後續分子生物學檢測時造成幹擾。此外，長期手動操作對實驗員的健康亦會造成潛在性的威脅。綜上所述，目前相關技術中常見的提純循環腫瘤細胞的方法存在操作複雜、自動化程度低、通量低以及敏感性較低(依賴於腫瘤細胞的特性、離心的時間、溫度等多種因素)等技術問題。有鑑於此，特提出本發明。技術實現要素：本發明的第一目的在於提供一種高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的裝置，該裝置用於快速捕獲提純循環腫瘤細胞，具有自動化程度高、高通量、不易引起交叉汙染等效果。本發明的第二目的在於提供一種利用所述的高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的裝置提純循環腫瘤細胞的方法，該方法操作簡便，克服了現有技術中常見的循環腫瘤細胞提純操作多依賴人工操作而存在的對實驗人員會造成的潛在威脅。為了實現本發明的上述目的，特採用以下技術方案：本發明提供了一種高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的裝置：所述高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的裝置包括：過濾模塊；所述過濾模塊包括過濾器、設置在過濾器內部並與過濾器內壁密封的濾膜、負壓裝置；所述負壓裝置連接在所述過濾器的出口一端，用於使所述過濾器的內部保持負壓；所述濾膜用於當所述負壓裝置使所述過濾器的內部保持負壓時，將循環腫瘤細胞截留。本發明提供的這種高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的裝置，其包括了過濾模塊，而該過濾模塊中，包括了過濾器、設置在過濾器內部並與過濾器內壁密封的濾膜以及連接在所述過濾器的出口一端負壓裝置；在捕獲提純循環腫瘤細胞的過程中，預先將樣本液輸入到過濾器內部，負壓裝置可以使得過濾器內部形成負壓，並且使得樣本液透過濾膜，從過濾器的出口端排出。在樣本液透過濾膜的過程中，樣本液所含的循環腫瘤細胞由於其體積較其他血液細胞大，進而會被濾膜截留，從而實現了高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的效果；由於將樣本液輸入到過濾器以及負壓裝置都可以自動控制，因此濾膜截留循環腫瘤細胞的過程具有自動化程度高，高通量(增加過濾器數量即可實現)等效果。且在同時操作多個過濾器時，每個過濾器及濾過液流經的管路均為獨立管路，無交叉汙染，濾過液可單獨收集用於其他分析或直接排入所述廢液收集裝置。可選的，所述高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的裝置還包括：試劑進樣模塊和第一負壓泵；所述試劑進樣模塊與所述過濾器連通，且所述第一負壓泵設置在所述試劑進樣模塊與所述過濾器的連通管路上。在對過濾器中的樣本液過濾之後，一般都會對截留在濾膜上的循環腫瘤細胞進行清洗、染色等操作，以滿足後續實驗分析的要求。因此，為了進一步地提高清洗以及染色的自動化程度，優選設置了試劑進樣模塊和第一負壓泵。使用時，在第一負壓泵的作用下，試劑進樣模塊中的試劑可被順利的導入到過濾器中，從而非常便於實現樣本液的清洗、染色操作。可選的，所述過濾器為多個，且所有所述過濾器與所述第一負壓泵的連通管路上設置有一試劑分配器。為了實現批量處理樣本液的效果，過濾器可優選為多個，而且所有所述過濾器與所述第一負壓泵的連通管路上設置有一試劑分配器；通過試劑分配器可以將從試劑進樣模塊輸入的試劑分配到多個過濾器中。更為優選的，多個過濾器(一般為8-10個)可以通過一個固定支架實現一體設置，形成一組固定的過濾器。當處理量較大時，可以並行設置多組過濾器。對於過濾器的結構，優選的，過濾器包括管體、密封圈、可放置濾膜的支架，濾膜設置在濾膜支架上，密封圈使得濾膜和濾膜支架、管體的內壁密封。可選的，所述試劑進樣模塊包括清洗液儲樣瓶、染色液儲樣瓶和保存液儲樣瓶；所述清洗液儲樣瓶、所述染色液儲樣瓶和所述保存液儲樣瓶通過一個多通道連接頭與所述第一負壓泵連接。一般來說，對於過濾後被截留的循環腫瘤細胞，多會進行清洗、染色以及封閉保存(如果不立即使用)的操作，因此，對於試劑進樣模塊，其優選包括清洗液儲樣瓶、染色液儲樣瓶和保存液儲樣瓶；且清洗液儲樣瓶、染色液儲樣瓶和保存液儲樣瓶通過一個多通道連接頭(便於將多個儲樣瓶與試劑分配器連接)與第一負壓泵連接。可選的，所述清洗液儲樣瓶、所述染色液儲樣瓶和所述保存液儲樣瓶與所述多通道連接頭的連通管路上分別設置有通道閥門。通過多個通道閥門可以方便地控制多個儲樣瓶內部試劑的流向，進一步地提高了自動化程度。可選的，還包括廢液收集裝置和第二負壓泵；所述過濾器的出口與所述廢液收集裝置連通；且所述過濾器的管壁上還設置有溢流口，所述溢流口與所述廢液收集裝置通過溢流管連通；所述第二負壓泵設置在所述溢流管上。由於濾器的出口與所述廢液收集裝置連通，因此經過過濾後的樣本液以及從儲樣瓶流出試劑使用完畢後可被廢液收集裝置收集。而且，由於溢流管以及第二負壓泵(較優為蠕動泵、真空泵)的設置，在操作開始時，啟動第二負壓泵，可主動預防由於濾膜堵塞引起的樣本液和試劑液溢出，從而最大限度的避免了高通量操作時樣本間的汙染，同時避免了有毒有害物質對儀器和操作人員的不良影響。可選的，還包括可編程式邏輯控制器；所述可編程式邏輯控制器與所有的所述通道閥門、所述負壓裝置、所述第一負壓泵、所述第二負壓泵、所述多通道連接頭以及所述試劑分配器相連，並用於控制所述通道閥門、所述負壓裝置、所述第一負壓泵、所述第二負壓泵、所述多通道連接頭以及所述試劑分配器的開/關狀態。通過可編程式邏輯控制器控制所述通道閥門、所述負壓裝置、所述第一負壓泵、所述第二負壓泵、所述多通道連接頭以及所述試劑分配器的開/關狀態，進一步地提高了整個循環腫瘤細胞捕獲過程中的自動化程度，減少了手動操作可能會導致的誤差以及試劑可對人體造成潛在危害的缺陷。可選的，所述濾膜為高分子聚合微孔膜(更具體的，為聚碳酸酯膜，聚酯膜；孔徑生產模式較優為蝕刻法)，且其孔徑為5-10μm。對於過濾器連接有負壓裝置的出口端，優選設置有錐形的濾過頭，每個過濾器的濾過頭都通過獨立的濾過液輸送管與濾過液收集管或廢液收集裝置相連，若濾過液收集在濾過液收集管中，由於每個樣本間及每批次樣本間均為獨立操作，最大限度的避免同批次樣本間和不同批次樣本間的交叉汙染，因此濾過液收集管中的濾過液仍可用於進行其他實驗分析。此外，對於濾膜優選為透明或半透明的高分子聚合微孔膜，也可為黑色無螢光背景的高分子聚合微孔膜，微孔膜的平均孔徑介於5-10μm，樣本液或試劑在過濾器內的流動，均通過負壓裝置(較優為蠕動泵、真空泵、柱塞泵、注射泵)形成負壓實現，而且5-10μm的高分子聚合微孔膜可以實現很好的循環腫瘤細胞截留。利用所述的高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的裝置提純循環腫瘤細胞的方法，包括如下步驟：將血液樣本輸送至過濾器內，啟動負壓裝置使所述過濾器形成負壓，並使血液樣本穿過濾膜的過程中，所含的腫瘤細胞截留在濾膜上。優選的，該方法具體包括以下步驟：1)、將樣本液固定後，加入至過濾器中，啟動負壓裝置，使得樣本液經過濾膜，且所含的循環腫瘤細胞被截留；2)、將被截留在濾膜上的循環腫瘤細胞依次利用磷酸鹽緩衝液清洗、利用染色液染色、利用磷酸鹽緩衝液清洗以及利用保存液保存，即得，其中，染色液是DAPI、AO、PI、hoechst、sybgreen、螢光標記抗體、伊紅美藍以及瑞氏-姬姆薩中的任意一種。該方法通過負壓抽濾的方式實現了循環腫瘤細胞的截留和染色，整個操作簡單易行，可控性強。與現有技術相比，本發明的有益效果為：(1)、該裝置整體結構連貫緊湊，為快速有效地捕獲提純循環腫瘤細胞的提供了保障，基於該裝置的結構優勢，可實現循環腫瘤細胞高自動化捕獲。(2)、通過自動控制整個裝置即可實現循環腫瘤細胞的分離、清洗以及染色和保存等操作，克服了現有技術中整個捕獲過程需要大量人工手動操作而可能存在的對實驗人員的潛在危害以及捕獲效率低等缺陷。(3)由於過濾器、管路及負壓裝置的特殊設計，使得每個樣本間及每批次樣本間均為獨立操作，最大限度的避免同批次樣本間和不同批次樣本間的交叉汙染，因此濾過液重新收集後，仍可用於進行其他實驗分析，極大的拓寬了設備的應用範圍，使得1管樣本進行多項檢測分析成為可能。(4)、該裝置和方法的結合，克服了現有技術中常見的手動捕獲循環腫瘤細胞的操作所具有的通量低、誤差大，且容易引起交叉汙染，特別是易於在後續分子生物學檢測時造成幹擾的缺陷。附圖說明為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，以下將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1為本發明提供的高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的裝置的結構示意圖附圖標記：0-試劑儲樣瓶，1-試劑進樣模塊，2-過濾模塊，3-主動防溢出模塊，4-自動控制模塊，5-廢液收集裝置；01為清洗液儲樣瓶，02為染色液儲樣瓶，03為保存液儲樣瓶，0X為可擴充試劑瓶，111-11X為試劑輸送管，121-12X為通道閥門，13多通道連接頭，14為第一負壓泵，15試劑分配器；21為過濾器固定支架，22為過濾器，23為濾膜，24濾過液輸送管，25為負壓裝置，26為濾過液輸送管密封夾，27為密封塞，221為管體，223為密封圈，224為可放置濾膜的支架，225為濾過頭，222為溢流口，31為溢流管，32為第二負壓泵，41為可編程式邏輯控制器，42為控制板；圖2為利用本發明的設備獲取和提純循環腫瘤細胞的結果圖。具體實施方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明製備廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。請參考圖1，本發明提供的這種高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的裝置，包括過濾模塊2；過濾模塊2包括過濾器22、設置在過濾器22內部並與過濾器22內壁密封的濾膜23、負壓裝置25；負壓裝置25連接在過濾器22的出口一端，用於使過濾器22的內部保持負壓；濾膜23用於當負壓裝置25使過濾器22的內部保持負壓時，將循環腫瘤細胞截留。在較為優選的方案中，該高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的裝置還包括：試劑進樣模塊1和第一負壓泵14；試劑進樣模塊1與過濾器22連通，且第一負壓泵14設置在試劑進樣模塊1與過濾器22的連通管路上。過濾器22為多個，且所有過濾器22與第一負壓泵14的連通管路上設置有一試劑分配器15。為了進一步地提高過濾後對截留的循環細胞的清洗以及染色的自動化程度，優選設置了試劑進樣模塊1和第一負壓泵14。使用時，在第一負壓泵14的作用下，試劑進樣模塊1中的試劑可被順利的導入到過濾器22中，從而非常便於實現樣本液的清洗、染色操作。為了實現批量處理樣本液的效果，過濾器22可優選為多個，而且所有過濾器22與第一負壓泵14的連通管路上設置有一試劑分配器15；通過試劑分配器15可以將從試劑進樣模塊1輸入的試劑分配到多個過濾器22中。在上述較為優選方案的基礎之上，優選的，試劑進樣模塊1包括清洗液儲樣瓶01、染色液儲樣瓶02和保存液儲樣瓶03；清洗液儲樣瓶01、染色液儲樣瓶02和保存液儲樣瓶03通過一個多通道連接頭13與第一負壓泵14連接。清洗液儲樣瓶01、染色液儲樣瓶02和保存液儲樣瓶03與試劑分配器15的連通管路上分別設置有通道閥門。通過多個通道閥門可以方便地控制多個儲樣瓶內部試劑的流向，進一步地提高了裝置的自動化程度。在上述方法的基礎之上，更為優選的，該高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的裝置進一步包括廢液收集裝置5和第二負壓泵32；過濾器22的出口與廢液收集裝置5連通；且過濾器22的管壁上還設置有溢流口222，溢流口222與廢液收集裝置5通過溢流管31連通；第二負壓泵32設置在溢流管31上。這樣，經過過濾後的樣本液以及從儲樣瓶流出試劑使用完畢後可被廢液收集裝置5收集或被重新收集到濾過液收集管中。而且，由於溢流管31以及第二負壓泵32(較優為蠕動泵、真空泵)的設置，在操作開始時，啟動第二負壓泵32，可主動預防由於濾膜23堵塞引起的樣本液和試劑液溢出，從而最大限度的避免了高通量操作時樣本間的汙染，同時避免了有毒有害物質對儀器和操作人員的不良影響。另外，為了實現進一步的自動化控制，在上述最為優選的方案的基礎之上，優選的，還設置可編程式邏輯控制器41；可編程式邏輯控制器與所有的通道閥門、負壓裝置25、第一負壓泵14、第二負壓泵32、多通道連接頭13以及試劑分配器15相連，並用於控制通道閥門、負壓裝置25、第一負壓泵14、第二負壓泵32、多通道連接頭13以及試劑分配器15的開/關狀態。基於以上的優選設置，進一步地提高了整個循環腫瘤細胞捕獲過程中的自動化程度，減少了手動操作可能會導致的誤差以及試劑可對實驗人員造成潛在危害的缺陷。此外，在上述所有的方案中，為了實現對循環重量細胞的大量截留，優選的，濾膜為高分子聚合微孔膜(聚碳酸酯膜，聚酯膜)，且其孔徑為5-10μm。請參考圖1，在本發明的另一技術方案中，該高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞設備包括：試劑儲樣瓶0、試劑進樣模塊1、過濾模塊2、主動防溢出模塊3、自動控制模塊4、廢液收集裝置5；試劑儲樣瓶0由多個試劑瓶組成，分別用以儲存樣品處理、染色、清洗、固定、保存時需要的試劑；附圖1中所示(但不僅限於此)，其中，01為清洗液儲樣瓶，02為染色液儲樣瓶，03為保存液儲樣瓶，0X為可擴充試劑瓶(例如為固定液儲樣瓶、保存液儲樣瓶等)，可根據提取染色需要增添若干相關試劑瓶(最多可擴充至10個儲樣瓶)。試劑進樣模塊1包括：試劑輸送管111-11X、通道閥門121–12X、多通道連接頭13、第一負壓泵14、試劑分配器15。試劑輸送管111-11X有多條，用以連通試劑儲樣瓶0與過濾器22，且每條試劑輸送管上分別設置有通道閥門121–12X，通過多個通道閥門121–12X可以方便地控制多個試劑儲樣瓶(01-0X)內部試劑的流向，進一步地提高了自動化程度。使用時，在第一負壓泵14的作用下，試劑儲樣瓶(01–0X)中的試劑可按順序被順利的分別導入到單個或多個過濾器22中，從而自動化地實現樣本液的清洗、染色操作。由於從樣本液過濾以截留循環腫瘤細胞，到將各種試劑輸入多個過濾器22對截留的循環腫瘤細胞進行清洗、固定、染色的所有步驟均可以自動控制，因此濾膜截留染色循環腫瘤細胞的全過程具有自動化程度高，高通量(增加過濾器數量即可實現)等效果。試劑進樣模塊1與試劑儲樣瓶(01–0X)相連，每種試劑從獨立試劑輸送管(111-11X)，通過多通道連接頭13進入試劑分配器15；試劑流動通過第一負壓泵14(較優為蠕動泵、柱塞泵、真空泵、注射泵)形成負壓推動試劑液體流動；每種試劑的獨立試劑輸送管路上均設有通道閥門(121–12X，較優為電磁閥)，用以控制通過該通道的試劑的開放和關閉時間；試劑分配器15具有定位和分配功能，可將進入分配器中的試劑均勻分配到過濾模塊2的多個過濾器22中；在染色液通道112上設有顆粒過濾器1121，用以過濾染色液中由於結晶形成的顆粒物，最大限度降低對染色後細胞的幹擾；所有通道閥門、負壓泵、多通道連接頭13以及試劑分配器15均與可編程式邏輯控制器41相連，並受編程程序控制。過濾模塊2包括：過濾器固定支架21、過濾器22、濾膜23、濾過液輸送管24、負壓裝置25；一組過濾器固定支架21上可同時固定8-10個過濾器22，多組過濾器固定支架21通過組合形式方便增加；過濾器22由管體221、密封圈223、可放置濾膜的支架224、濾過頭225組成；過濾器22的管體上設有溢流口222，該溢流口222與主動防溢流模塊3相連，用以防止由於濾膜23堵塞引起的樣本和試劑液溢出。管體221與濾膜23、可放置濾膜的支架224、濾過頭225拼裝組合形成濾器22；密封圈223用以密封管體221與濾膜23、可放置濾膜的支架224之間的空隙，便於後續負壓操作；每個過濾器22的濾過頭225都與獨立的濾過液輸送管24相連，最大限度的避免同批次樣本間和不同批次樣本間的交叉汙染，濾過液輸送管24最終與廢液收集裝置5相連，或與其他濾過液收集管相連；濾膜23為透明或半透明的高分子聚合微孔膜，也可為黑色無螢光背景的高分子聚合微孔膜，微孔膜的平均孔徑介於5-10μm；樣本試劑過濾及濾過液流動，均通過負壓裝置25(較優為蠕動泵、真空泵)形成負壓推動試劑液體流動；負壓裝置25與可編程式邏輯控制器41相連，並受編程程序控制。主動防溢出模塊3包括溢流管31、第二負壓泵32。溢流管31與過濾器22的管體221上的溢流口222相連，最終與廢液收集裝置5相連；溢流管路上接有第二負壓泵32(較優為蠕動泵、真空泵)，在樣本操作開始時即啟動負壓操作，主動預防由於濾膜23堵塞引起的樣本和試劑液溢出，從而最大限度的避免了高通量操作時樣本間的汙染，同時避免了有毒有害物質對儀器和操作人員的不良影響；第二負壓泵32與可編程式邏輯控制器41相連，並受編程程序控制。廢液收集裝置5與濾過液輸送管24，溢流管31相連，內裝病原微生物滅活試劑(較優為次氯酸鈉、酒精溶液等)用以滅活進入廢液收集裝置的濾過液或溢流液中的病原微生物，從而對操作環境和人員進行有效保護。自動控制模塊4用以控制試劑進樣模塊1、過濾模塊2、主動防溢出模塊3的可編程式邏輯控制器41，可編程式邏輯控制器4.1可與電腦或控制板42相連，用以按照編程程序按順序和時間調控各個控制器，或按具體要求更改操作程序及時間。接下來，結合以上的內容，對本發明的利用高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞設備快速捕獲循環腫瘤細胞的方法舉出以下具體實施例：本發明提供的這種快速捕獲循環腫瘤細胞的方法具體包括如下的步驟：1、血液樣本(樣本液)的過濾：a)在2ml外周血液樣本中加入3ml4％多聚甲醛溶液，處理10分鐘，對外周血中的細胞進行固定，同時對可能的病原微生物進行滅活。b)一次性或分批加入組裝好的過濾器22中，每次加入後過濾器2.2中的液面應低於過濾器22的溢流口222的最下端；c)啟動負壓裝置25，並持續運行10-15分鐘，使血液樣本在負壓作用下全部穿過濾膜23，使循環腫瘤細胞得以被微孔膜截留在膜表面。在該步驟中，由於循環腫瘤細胞的直徑大於紅細胞及絕大部分血液有核細胞，因此，循環腫瘤細胞得以被微孔膜截留在濾膜23表面，而紅細胞及血液有核細胞則穿過微孔膜通過獨立的濾過液輸送管24最終進入廢液收集裝置5，並被病原微生物滅活試劑將濾過液中可能存在的病原微生物滅活，或將濾過液收集入其他濾過液收集管，用於其他檢測分析。固定液可為任何有固定細胞樣本作用的試劑，較優為多聚甲醛、甲醛等醛類固定液；或者，較優為甲醇、乙醇、及無醛類固定液。2、微孔膜上循環腫瘤細胞的清洗：a)在血液樣本過濾步驟完成後，立即啟動第二負壓泵32(其後始終開啟)，同時第一負壓泵14；b)開啟清洗液通道閥門121，清洗液磷酸鹽緩衝液(pH7.4)在第一負壓泵14作用下，從清洗液儲樣瓶01進入清洗液輸送管道111，清洗液再經過多通道連接頭13和試劑分配器15均勻分配到多個過濾器22中；c)在第一負壓泵14開啟1-2分鐘後，再次開啟負壓裝置25，使過濾器22中的清洗液穿過濾膜，起到對濾膜23及其上所截留的細胞的清洗作用。其中，在上述的步驟中，清洗液通道閥門121和第一負壓泵14的開啟時長為5分鐘，隨後清洗液通道閥門121關閉，第一負壓泵14停止；而負壓裝置25開啟，時長為10-15分鐘，直至過濾器22中的所有清洗液排空。此外，清洗液除了選擇磷酸鹽緩衝液(pH7.4)外，還可為生理鹽水、5％葡萄糖溶液等。3、濾膜上循環腫瘤細胞的染色：a)在清洗步驟完成後，暫停負壓裝置25，再次開啟第一負壓泵14，同時開啟染色液通道閥門122；b)染色液即瑞氏-姬姆薩染色液(染色液類別根據實際情況進行選擇)在第一負壓泵14作用下，從染色液儲樣瓶02進入染色液輸送管道112，隨後經過顆粒過濾器1121，經多通道連接頭13和試劑分配器15均勻分配到多個過濾器22中；c)在負壓裝置25暫停15-20分鐘後，再次開啟負壓裝置25，使過濾器22中的染色液穿過濾膜23，起到對濾膜23上的細胞染色的作用，直至過濾器22中的所有染色液排空。上述步驟中，染色液通道閥門122和第一負壓泵14的開啟時長為5分鐘，隨後染色液通道閥門122關閉，第一負壓泵14停止；而負壓裝置25在第一負壓泵14停止後，繼續停止15-20分鐘，隨後負壓裝置25開啟，時長為1-2分鐘，直至過濾器22中的所有染色液排空。需指出的是，除了瑞氏-姬姆薩染色液，該步驟中的染色液也可以是細胞核或/及細胞漿螢光染色液，較優為DAPI、AO、PI、hoechst、sybgreen等染色液，還可以是各種真核細胞染色液，如，伊紅美藍染色液。4、濾膜上循環腫瘤細胞螢光標記抗體染色(可選)為進一步區分濾膜上白細胞及循環腫瘤細胞，可選用螢光標記的CD45抗體對濾膜上的循環腫瘤細胞進行負選染色。a)在步驟3之前或完成後，暫停負壓裝置25，再次開啟第一負壓泵14，同時開啟螢光標記CD45抗體染色液通道閥門12X；b)螢光標記CD45抗體染色液在第一負壓泵14作用下，從螢光標記CD45抗體染色液儲樣瓶0X進入染色液輸送管道11X，經多通道連接頭13和試劑分配器15均勻分配到多個過濾器22中；c)在負壓裝置25暫停60-90分鐘後，再次開啟負壓裝置25，使過濾器22中的螢光標記CD45抗體染色液穿過濾膜23，起到對濾膜23上的細胞抗體標記染色的作用，直至過濾器22中的所有染色液排空。上述步驟中，染色液通道閥門122和第一負壓泵14的開啟時長為1分鐘，隨後染色液通道閥門12X關閉，第一負壓泵14停止；負壓裝置25在第一負壓泵14停止後，繼續停止60-90分鐘，隨後開啟，時長為1-2分鐘，直至過濾器22中的所有染色液排空。需指出的是，除了螢光標記CD45抗體染色液，該步驟的螢光標記抗體染色液還可以根據待分析組織特性或癌細胞類型進行選擇。5、染色後清洗步驟：該步驟的具體操作與步驟2一致，且清洗次數為兩次，在此不作贅述。6、膜上細胞保存步驟(可選)：a)若染色後細胞並不馬上用於後續分析，為保證細胞結構、染色結果及細胞內核酸的穩定，可採用本步驟；b)在染色後清洗步驟完成後，暫停負壓裝置25，再次開啟第一負壓泵14，同時開啟保存液通道閥門(圖中標號為123)；c)保存液在第一負壓泵14作用下，從保存液儲樣瓶03進入保存液輸送管道113，保存液經過多通道連接頭13和試劑分配器15均勻分配到多個過濾器22中；d)在保存液進入過濾器22並可覆蓋濾膜23後，關閉所有負壓泵以及負壓裝置，用濾過液輸送管密封夾26和溢流管密封夾33進行封閉，封閉後，將整個過濾器22取下，在過濾器頂部塞入密封塞27後，將過濾器22置於4-25℃保存；e)上述步驟中，保存液可為任何可溶於水或乙醇的封片劑，較優為抗螢光淬滅封片液、甘油、甘油與水或其他緩衝液按不同比例混合的溶液、聚乙烯醇、聚乙烯醇與水或其他緩衝液按不同比例混合的溶液等；f)採用本步驟保存後的細胞，在進行後續計數及提純分析前，可優選再次採用清洗步驟1次，所用清洗液可為清洗步驟中給的中性等滲透緩衝液或乙醇，以降低保存液對後續分析造成幹擾的可能性。7、膜上循環腫瘤細胞計數及提純步驟：a)為了對循環腫瘤細胞進行計數分析，將染色後的濾膜23從過濾器22中取出，平鋪在乾淨的載玻片或襯膜上，然後放入數字病理掃描設備中，選用合適波長對濾膜進行掃描，由於染色後的循環腫瘤細胞與血液中有核血細胞的細胞核形態及表面螢光標記上存在很大差異，可方便區分，因此可對掃描後的結果進行計數分析；b)掃描結束後將濾膜放在襯膜上，然後在雷射顯微切割儀下將循環腫瘤細胞用雷射切割下來，並分別收集在不同離心管中，用於後續分子生物學分析；c)對於循環腫瘤細胞周圍的可疑有核血細胞，為防止其對切割後的循環腫瘤細胞分子生物學分析造成幹擾(有核血細胞非常容易對循環腫瘤細胞分子生物學分析造成顯著幹擾)，創新性的採用切割前單光束大功率雷射擊穿技術，破壞可疑細胞及核酸分子，最大限度的防止非特異性擴增和幹擾。試驗例對以上述的高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的方法同時處理多個樣本液，測定循環腫瘤細胞的截留率及平行性，具體操作方法如下：S1：將預定量的1000個人宮頸癌HeLa細胞投加到2ml磷酸緩衝液中，然後按本發明操作方法上機過濾，同時測定10個相同樣本；S2：過濾後用數字病理系統和計數分析軟體對膜上細胞進行拍照計數，細胞截留率＝(膜上計數結果/1000)×100％.結果顯示(請參見表1)，利用本發明設備和方法可對多個樣本進行處理，細胞截留率均高於75％，且樣本間平行性好。表1：同時處理多個樣本時腫瘤細胞的截留率及平行性過濾器編號1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#細胞截留率78.2％75.9％79.3％80.6％76.7％76.1％78.9％79.1％81.3％75.1％此外，在圖2中，示出了利用本發明的設備獲取和提純循環腫瘤細胞的結果：被黑色曲線圈出的部分是截留在濾膜上的循環腫瘤微栓；右側小圖是採用切割前單光束大功率雷射擊穿技術破壞了周邊可疑有核血細胞後，用顯微切割技術提純的循環腫瘤微栓；通過圖2可以看出，本發明提供的這種提純循環腫瘤細胞的裝置及其方法對循環腫瘤細胞實現了較好的分離提純效果。綜上，本發明提供的該裝置以及方法，在樣本液透過濾膜的過程中，樣本液所含的循環腫瘤細胞由於其體積較其他血液細胞大，進而會被濾膜截留，實現了高通量快速捕獲提純循環腫瘤細胞的效果；由於將樣本液輸入到過濾器以及負壓裝置(可優選為一負壓泵)都可以自動控制，因此濾膜截留循環腫瘤細胞的過程具有自動化程度高，高通量(通過增加過濾器數量即可實現)等效果。最後應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；儘管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，但本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的範圍。當前第1頁1 2 3