一種特異檢測ApoE4基因型的試劑盒及其應用的製作方法

2023-05-26 13:42:56 2

專利名稱：一種特異檢測ApoE4基因型的試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學的領域，具體是ー種快速、特異性檢測ApoE4基因型的試劑盒及其應用。
背景技術：
人類的載脂蛋白E(Ap0lip0pr0tein Ε,ApoE)由19qll. 2所編碼，其基因常見有3 種表型，即ε 2、ε 3和ε 4等位基因所編碼的3種載脂蛋白Ε2、Ε3和Ε4，構成6種不同的基因型。包括3種純合子(ε 2/ ε 2、ε 3/ ε 3、ε 4/ ε 4)禾ロ 3種雜合子(ε 2/ ε 3、ε 3/ ε 4、 ε 2/ ε 4)。等位基因的改變造成ΑροΕ4對LDL受體親和力更大，即ΑροΕ4 > ΑροΕ3 > ΑροΕ2， 從而影響脂蛋白代謝及血脂水平，ΑροΕ4/4基因型已作為心腦血管病發病的獨立危險因素。 由於ApoE基因與胰島素抵抗(IR)、肥胖等相關，因此檢測ApoE基因型對醫學分子流行病的研究有重要意義。目前，醫學分子流行病檢測ΑροΕ4基因型的方法主要是PCR-RFLP，首先從外周血抽提基因組DNA，選用ApoE外顯子4側翼序列設計引物進行ΑροΕ4的擴增，Hha I進行酶切， 然後對酶切產物進行垂直非變性PAGE進行分離，以確定其基因型。但是此種方法採樣要求高，檢測繁瑣，不利於流行病學普查的使用，且創傷性的抽血獲得基因組DNA並非被每個個體所接受，尤其是正常對照組的個體。ApoE外顯子4序列GC含量很高，不易擴增，對基因型的檢測結果有很大影響，有必要對擴增條件進行優化。因此，建立一種簡單易行、無創傷的抽提基因組DNA，高效特異性擴增ApoE 4基因片段，快速檢測ApoE4基因型的方法對ApoE4 基因型相關的分子流行病學和預防醫學的研究有重要的意義。

發明內容
本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供ー種判定時間短，準確性高的特異性檢測ApoE4基因型的試劑盒及其應用。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現ー種特異檢測ApoE4基因型的試劑盒，其特徵在幹，該試劑盒由以下試劑組成 4wt%蔗糖水、10mmol/L的NaOH溶液、lmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl (pH 7. 5)溶液、ニ甲基亞碸(DMSO)、試劑I、試劑II、限制性核酸(Hha I)內切酶、IOXM Buffer。所述的試劑盒由表1所述配比的試劑組成，表 權利要求
1.ー種特異檢測ApoE4基因型的試劑盒，其特徵在幹，該試劑盒由以下試劑組成 4wt%蔗糖水、10mmol/L的NaOH溶液、lmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl (pH 7. 5)溶液、分析純ニ甲基亞碸(DMSO)、試劑I、試劑II、限制性核酸(Hha I)內切酶、IOXM Buffer。
2.根據權利要求1所述的ー種特異檢測ApoE4基因型的試劑盒，其特徵在幹，所述的試劑盒由表1所述配比的試劑組成，表1
3.—種如權利要求1所述的特異檢測ApoE4基因型的試劑盒的應用，其特徵在幹，試劑盒的應用的步驟如下(1)樣本的製備和貯存10mL4%蔗糖水漱ロ IOs後3000r/min離心5min收集含有頰黏膜上皮細胞的沉澱，獲取的標本若在短時間檢測可貯存於-20°C，若在長時間檢測可貯存於-80°C或液氮中備用；(2)進行ApoE4基因的PCR擴增；(3)ApoE4PCR產物經HhaI酶切後，酶切產物進行15% PAGE電泳；(4)參照Richard方法即可以簡化判定ApoE4基因型。
4.根據權利要求3所述的ー種特異檢測ApoE4基因型的試劑盒的應用，其特徵在幹，所述的ApoE4基因在利用PCR擴增，採用5wt%的ニ甲基亞碸對PCR反應程序進行優化，擴增的退火溫度為70°C。
全文摘要
本發明涉及一種特異檢測ApoE4基因型的試劑盒及其應用，試劑盒由以下試劑組成4％蔗糖水、10mmol/L NaOH溶液、1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)溶液、DMSO、試劑I、試劑II、Hha I內切酶、10×M Buffer。其應用樣本的製備和貯存；抽提基因組DNA；ApoE4基因的PCR擴增；ApoE4基因型的鑑定。與現有技術相比，本試劑盒提供的試劑可以無創穫取個體的基因組DNA；高效擴增ApoE4基因，快速準確判定ApoE4的基因型，並可同時進行大量個體的基因型判定；判定時間短、準確性高，適用於分子流行病學和預防醫學大規模篩查工作。
文檔編號C12Q1/68GK102586404SQ20111000277
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月7日 優先權日2011年1月7日
發明者呂立夏, 張介平, 徐國彤, 谷輝傑, 鄧佳齊 申請人:同濟大學