對節白蠟中具有殺菌活性的揮發性提取物及其殺菌組合物的製作方法

2023-05-26 14:45:56 4

本發明涉及一種生物農藥技術領域，具體涉及一種對節白蠟中具有殺菌活性的揮發性提取物及其殺菌組合物。

背景技術：

農藥是現代農業的重要生產資料，對於保證農作物優質、高產具有不可或缺的作用。我國是農業大國，如何利用我國僅佔世界7％的耕地面積來養活我國佔世界總人口22％的人口，是我國國民經濟的首要任務。化學農藥在農業生產中起到重要作用，但由於長期不合理使用，致使出現3R(Resistance，Resurgence，Residue)現象，給生態環境和人類健康帶來隱患。當今人們對環境更高要求以及食品安全的迫切需求，使得合理使用農藥，創製高效、低毒、環境友好的綠色農藥成為人們關注的焦點。

植物源農藥具有易分解、與環境相容性好、對非靶標生物相對安全等優點，符合現代環保和人們健康的要求，因而越來越引起人們的高度重視。我國是利用植物資源防治病蟲害最早的國家。早在周朝的《周禮秋官》中就有芥草燻殺蠹物的記載。李時珍所著的《本草綱目》記錄了不少可以用來殺蟲的植物，如百部、苦參、川楝、巴豆等。我國植物源農藥商品化生產則始於新中國成立初期，其標誌性產品是除蟲菊素製劑、魚藤酮製劑及菸鹼製劑。目前已有菸鹼、除蟲菊素、百部鹼、馬錢子鹼、異羊角拗苷、茶皂素、蛇麻子素、莨菪烷類生物鹼、瑞香狼毒等多種植物源殺蟲劑及苦參鹼、黃苓苷及黃苓素、小檗鹼、丁香酚、檸檬醛等植物源殺菌劑完成了登記或臨時登記。

對節白蠟(Fraxinus hupehensis)是湖北長江大學蘇丕林教授於1975年首次發現的白蠟屬新種，發現之初，僅分布於湖北省鍾祥京山大洪山南麓山丘地帶，因此又名：湖北梣、湖北白蠟、對節樹、望鄉樹。對節白蠟是我國二級珍稀保護植物，具有很好的應用價值：樹皮作為中藥秦皮的來源之一，具有重要的藥用價值；對節白蠟是世界僅存的木犀白蠟名貴樹種，是世界景點、盆景、根雕家族的極品；對節白蠟盆景被譽為「活化石」或「盆景之王」。目前關於對節白蠟的研究主要集中在園林、園藝及景觀領域；對其化學成分及提取物等相關研究，僅有華中科技大學的馬力等就對節白蠟中的秦皮甲(乙)素和黃酮總量的提取、分析進行過相關文章報導，且側重於醫藥用途。

特別引起我們注意的是，對節白蠟鮮有病蟲害，蚜蟲、蟎蟲、線蟲、紅蜘蛛等均不會對其造成影響。僅是嫩芽剛出時，芽梢會偶受病蟲影響，數天後芽葉老化，危害會自動消除。白粉病、立枯病等均不對其造成危害。我們分析認為，對節白蠟很有可能自身能夠產生抗蟲、抗病的活性物質，幫助其免於病蟲害的影響。而有關對節白蠟抗蟲抗病方面的研究目前尚無報導。

技術實現要素：

針對現有技術中存在的問題，本發明的目的在於提供一種對節白蠟中具有殺菌活性的揮發性提取物及其殺菌組合物，可作殺蟲、殺菌劑使用，用於防治農作物病害。

為實現上述目的，本發明所採用的技術方案為：一種對節白蠟中具有殺菌活性的揮發性提取物，該揮發性提取物是由以下方法製備得到：將對節白蠟的根、莖、葉、花和/或種子於-5～0℃下低溫粉碎處理後，加入同時蒸餾萃取裝置(SDE)中於50～150℃的溫度下進行蒸餾萃取1～72小時，冷卻至室溫，靜置分層，取有機相，將有機相用乾燥劑進行脫水，過濾除去乾燥劑，並於真空中在-100℃～30℃溫度下脫除萃取溶劑即可得到對節白蠟具有殺菌活性的揮發性提取物；蒸餾萃取中用到的萃取劑選自酯、酮、醚、氯代烷烴、芳烴或烷烴。

本發明還提供了一種殺菌組合物，所述殺菌組合物由用上述所述的揮發性提取物和載體組成。

本發明殺菌組合物中的載體系滿足下述條件的物質：它與活性成分配製後便於施用於待處理的位點，例如可以是植物、種子或土壤；或者有利於貯存、運輸或操作。載體可以是固體或液體，包括通常為氣體但已壓縮成液體的物質，通常在配製殺蟲、殺菌組合物中所用的載體均可使用。

本發明還提供了一種如上述所述的殺菌組合物的應用，殺菌組合物通常加工成濃縮物的形式並以此用於運輸，在施用之前由使用者將其稀釋。所述殺菌組合物的劑型為可溼性粉劑、顆粒劑、泡騰片劑、可乳化的濃縮劑、水乳劑、懸浮濃縮劑、氣霧劑或煙霧劑。

本發明還提供了一種如上述所述的殺菌組合物的用途，作為殺蟲劑、殺菌劑使用，用於防治水稻紋枯病、小麥赤黴病、馬鈴薯早疫病、核桃根腐病、油菜菌核病等病蟲害。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：本發明的對節白蠟中提取的揮發性提取物具有廣譜的殺菌活性，可作為殺蟲、殺菌劑使用，對水稻紋枯病、小麥赤黴病、馬鈴薯早疫病、核桃根腐病、油菜菌核病等病蟲害具有較顯著的殺菌抑制作用。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行詳細描述，本部分的描述僅是示範性和解釋性，不應對本發明的保護範圍有任何的限制作用。

本發明的一種對節白蠟中具有殺菌活性的揮發性提取物，該揮發性提取物是由以下方法製備得到：將對節白蠟的根、莖、葉、花和/或種子於-5～0℃下低溫粉碎處理後，加入同時蒸餾萃取裝置(SDE)中於50～150℃的溫度下進行蒸餾萃取1～72小時，冷卻至室溫，靜置分層，取有機相，將有機相用乾燥劑進行脫水，過濾除去乾燥劑，並於真空中在-100℃～30℃溫度下脫除萃取溶劑即可得到對節白蠟具有殺菌活性的揮發性提取物；蒸餾萃取中用到的萃取劑選自酯、酮、醚、氯代烷烴、芳烴或烷烴。

作為進一步優選的，所述萃取劑為乙酸乙酯和乙醚的混合物。

作為進一步優選的，所述乾燥劑為5A分子篩、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、或無水氯化鈣中的兩種或兩種以上的混合物。

作為進一步優選的，蒸餾萃取過程中，萃取溫度優選為60℃～120℃，特別是80℃～100℃，萃取時間優選為優選3～24小時，特別是6～12小時。

作為進一步優選的，在真空中脫除溶劑的溫度優選為於-50℃～0℃，特別是-30℃～-10℃。

本發明還提供了一種殺菌組合物，所述殺菌組合物由用上述所述的提取物和載體組成。

本發明殺菌組合物中的載體系滿足下述條件的物質：它與活性成分配製後便於施用於待處理的位點，例如可以是植物、種子或土壤；或者有利於貯存、運輸或操作。載體可以是固體或液體，包括通常為氣體但已壓縮成液體的物質，通常在配製殺蟲、殺菌組合物中所用的載體均可使用。

固體載體包括：天然或合成的粘土和矽酸鹽，其中粘土中較佳為硅藻土、滑石、矽鎂土或高嶺土；矽酸鹽中較佳為碳酸鈣、硫酸鈣、氧化矽、矽酸鈣、矽酸鋁、蒙脫石或雲母；元素如碳或硫；天然的或合成的樹脂如苯並呋喃樹脂；聚氯乙烯和苯乙烯聚合物或共聚物；固體多氯苯酚；瀝青；蠟如蜂蠟或石蠟。

液體載體包括：水；醇類化合物如乙醇或異丙醇；酮類化合物如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丙基酮或環己酮；醚；芳香烴化合物如苯、甲苯、二甲苯或溶劑油；石油餾分如煤油或礦物油；生物材油；通常，這些液體的混合物也是合適的。

作為進一步優選的，所述載體為粘土、矽酸鹽、醇類化合物、酮類化合物、樹脂、聚氯乙烯和苯乙烯聚合物或共聚物、多氯苯酚、芳香烴化合物、石油餾分、生物柴油中的一種或多種的混合物。

作為進一步優選的，所述粘土為硅藻土、滑石、矽鎂土或高嶺土；所述矽酸鹽為碳酸鈣、硫酸鈣、氧化矽、矽酸鈣、矽酸鋁、蒙脫石或雲母。

作為進一步優選的，所述醇類化合物為乙醇或異丙醇；所述酮類化合物為丙酮、甲基乙基酮、甲基異丙基酮、環己酮、苯、甲苯或二甲苯。

作為進一步優選的，所述載體中還可添加表面活性劑，少量表面活性劑的存在有助於稀釋過程。

本發明還提供了一種如上述所述的殺菌組合物的應用，殺菌組合物通常加工成濃縮物的形式並以此用於運輸，在施用之前由使用者將其稀釋。所述殺菌組合物的劑型為可溼性粉劑、顆粒劑、泡騰片劑、可乳化的濃縮劑、水乳劑、懸浮濃縮劑、氣霧劑或煙霧劑。

本發明還提供了一種如上述所述的殺菌組合物的用途，作為殺蟲劑、殺菌劑使用，用於防治水稻紋枯病、小麥赤黴病、馬鈴薯早疫病、核桃根腐病、油菜菌核病等病蟲害。

實施例1

將陰乾的對節白蠟樹葉於0℃下低溫粉碎，準確稱取100.0g粉末樣品，放入1000mL的同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的蒸餾瓶中，加入300mL超純水，加入少量玻璃珠，於250mL同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的接收瓶中加入50mL乙酸乙酯和乙醚的萃取溶劑，於150℃的溫度下加熱回流提取6小時，冷卻至室溫，靜置分層，收集有機相，加入20g無水硫酸鈉和無水氯化鈣脫水30min，過濾取濾液，濾餅用10倍體積的乙醚淋洗1遍，合併濾液，濾液經真空冷凍乾燥儀於-20℃下脫除乙酸乙酯和乙醚，得到對節白蠟揮發性提取物。

實施例2

將陰乾的對節白蠟樹葉於-5℃下低溫粉碎，準確稱取100.0g粉末樣品，放入1000mL的同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的蒸餾瓶中，加入300mL超純水，加入少量玻璃珠，於250mL同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的接收瓶中加入50mL氯仿和乙醚的萃取溶劑，於50℃的溫度下加熱回流提取72小時，冷卻至室溫，靜置分層，收集有機相，加入30g無水硫酸鎂和5A分子篩脫水50min，過濾取有機相，濾餅用10倍體積的乙醚淋洗1遍取濾液，合併濾液和有機相，然後經真空冷凍乾燥儀於-100℃下脫除氯仿和乙醚，得到對節白蠟揮發性提取物。

實施例3

將陰乾的對節白蠟樹葉於-5℃下低溫粉碎，準確稱取100.0g粉末樣品，放入1000mL的同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的蒸餾瓶中，加入300mL超純水，加入少量玻璃珠，於250mL同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的接收瓶中加入50mL丙酮和乙醚的萃取溶劑，於50℃的溫度下加熱回流提取72小時，冷卻至室溫，靜置分層，收集有機相，加入20g無水硫酸鈉和無水氯化鈣脫水30min，過濾取有機相，濾餅用10倍體積的乙醚淋洗1遍取濾液，合併濾液和有機相，然後經真空冷凍乾燥儀於-100℃下脫除丙酮和乙醚，得到對節白蠟揮發性提取物。

實施例4

將陰乾的對節白蠟樹葉於-5℃下低溫粉碎，準確稱取100.0g粉末樣品，放入1000mL的同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的蒸餾瓶中，加入300mL超純水，加入少量玻璃珠，於250mL同時同時蒸餾萃取裝置(SDE)(SDE)的接收瓶中加入50mL甲苯、新戊烷和乙醇的萃取溶劑，於80℃的溫度下加熱回流提取36小時，冷卻至室溫，靜置分層，收集有機相，加入50g無水硫酸鈉、無水硫酸鎂和無水氯化鈣脫水20min，過濾取有機相，濾餅用10倍體積的乙醇淋洗1遍取濾液，合併濾液和有機相，然後經真空冷凍乾燥儀於30℃下脫除甲苯、新戊烷和乙醇，得到對節白蠟揮發性提取物。

實施例5

可溼性粉劑按重量百分數計由以下成份組成：

各組分混合在一起，在粉碎機中粉碎，直到顆粒達到標準。

實施例6

乳油按重量百分數計由以下成份組成：

將對節白蠟揮發性提取物、PEO-10及乙氧基化甘油三酸酯溶於生物柴油中，得到透明的溶液。

實施例7

水懸浮劑按重量百分數計由以下成份組成：

對節白蠟揮發性提取物與70％的應加入水量以及十二烷基苯磺酸鈉在球磨機中粉碎，其他組分溶解在其餘水中，攪拌加入，混合均勻得水懸浮劑。

以下以實施例1為例，對製備得到的對節白蠟揮發性提取物進行成分分析和殺菌活性測定。

1、將對節白蠟揮發性提取物用GC-MS聯用儀對揮發性成分進行分析：

樣品處理：取0.05g對節白蠟揮發性提取物，加入1mL色譜純乙腈溶解，用0.45um濾膜過濾至1mL樣品瓶中，待分析。

GC-MS分析條件：色譜條件:HP-INNO-Wax彈性石英毛細管柱(30m×250μm×0.25μm)；色譜柱初始溫度40℃保持2min，以6℃/min速率升溫至120℃保持2min，之後以4℃/min升溫速率升至180℃保持2min，最後以10℃/min速率升溫至280℃保持2min；進樣口溫度為250℃，載氣為99.999％的氦氣，載氣流量為1.0m L/min；採用不分流模式。質譜條件:採用EI源，電子能量70eV，離子源溫度230℃，MS四極杆溫度150℃，傳輸線溫度280℃，質量掃描範圍:50～400amu。

採用上述條件對樣品進行GC-MS聯用儀分析，分析結果經NIST11譜庫檢索，並根據離子峰輔以人工解析、結構篩選，得到對節白蠟揮發性提取物中所含化合物的結構及含量如表1所示。

表1

2、殺菌活性測定：

實驗方法如下：將對節白蠟殺菌活性提取物用丙酮或二氯甲烷或DMSO溶解製備成一定濃度的母液，在無菌操作條件下，把配製好的母液用培養基稀釋10倍製成的含毒培養基平板，實驗設不含藥劑處理的空白對照，各重複3次。

按照中華人民共和國農業行業標準(NY/T 1156.2-2006)，採用菌絲生長速率法進行測定。將培養好的各種病原菌，在無菌操作條件下用直徑5mm的滅菌打孔器，自菌落邊緣切取菌餅，用接種器將菌餅接種於含藥平板中央，菌絲面向下，蓋上皿蓋，置於25℃培養箱中培養。

根據空白對照培養皿中菌落的生長情況調查病原菌菌絲生長情況，待空白對照中的菌落充分生長後，以十字交叉法測量各處理的菌落直徑，採用下面公式計算菌落增長直徑，取其平均值。

菌落增長直徑＝菌落直徑-菌餅直徑

測定結果用下列方法計算，以空白對照菌落增長直徑和藥劑處理的菌落增長直徑計算各藥劑處理對各種病原菌的菌絲增長抑制率(參見下面公式)。

菌絲生長抑制率(％)＝[(對照菌落增長直徑-藥劑處理菌落增長直徑)/空白對照菌落增長直徑]×100

殺菌活性測試結果如表2所示：

表2

由表2可知，通過本發明的對節白蠟中製備得到的提取物對水稻紋枯病、小麥赤黴病、馬鈴薯早疫病、核桃根腐病、油菜菌核病等病蟲害具有較明顯的殺菌抑制效果。

以上所述，僅是本發明的較佳實施例，並非對本發明的技術範圍作出任何限制，故凡是依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何細微修改、等同變化與修飾，均仍屬於本發明的技術方案範圍內。