人絨毛膜促性腺激素的純化方法

2023-06-12 04:20:56 1

專利名稱：人絨毛膜促性腺激素的純化方法
技術領域：
本發明涉及一種激素類藥物的純化方法，具體涉及一種人絨毛膜促性腺激素的純化方法。
背景技術：
人絨毛膜促性腺激素(HCG)是由胎盤的滋養層細胞分泌的一種糖蛋白，能夠維持月經黃體的壽命，使月經黃體增大成為妊娠黃體；它還能促進雄激素被芳香化從而轉化為雌激素，同時刺激孕酮形成；抑制植物凝集素對淋巴細胞的刺激作用，避免胚胎滋養層細胞被母體淋巴細胞攻擊；刺激胎兒睪丸分泌睪酮，促進男性性分化；與母體甲狀腺細胞TSH受體結合，刺激甲狀腺活性。在臨床上，人絨毛膜促性腺激素被用於女性無排卵或卵泡成熟障礙引起的不育症，也是輔助生育技術控制性超量刺激方案的一部分。它還被用於治療男性低促性腺激素性性功能低下，精子生成不足引起的不育以及促性腺垂體功能不足引起的青春期延遲和隱睪。目前，人絨毛膜促性腺激素的生產工藝還普遍存在著收率不高的缺陷，製得的產品純度也有待於進一步提高。

發明內容
因此，本發明的目的是提供一種人絨毛膜促性腺激素的純化方法，相比已有生產工藝，該純化方法獲得人絨毛膜促性腺激素純度和收率更高，更有利於該藥物的臨床應用和運輸、保存。本發明提供的人絨毛膜促性腺激素的純化方法包括以下步驟(1)將人絨毛膜促性腺激素粗品溶解於pH值為4 5的0. 05mol/L醋酸鈉緩衝液後，加到載體為瓊脂糖、葡聚糖凝膠或羥磷酸鈣的羧甲基陽離子交換層析柱上，以PH值為4 5的包含0. 05mol/L醋酸鈉和0. 2 0. 5mol/L氯化鈉的緩衝液洗脫，收集270 ^Onm，優選為280nm下光密度為0. 6 0. 7的洗脫液；(2)將洗脫液進行脫鹽濃縮；(3)再加到載體為瓊脂糖、葡聚糖凝膠或羥磷酸鈣的羧甲基陽離子交換層析柱上， 以PH值為5. 5 6. 5的0. 05 0. Imol/L醋酸鈉緩衝液洗脫，收集270 ^Onm，優選為 280nm下光密度為0. 6 0. 7的洗脫液；在上述純化方法中，HCG在^Onm處有最大吸收。在步驟(1)中，優選地，以pH值為4 5的包含0. 05mol/L醋酸鈉和0. 2 0. 5mol/ L氯化鈉的緩衝液洗脫之前以pH值為4 5的0. 05mol/L醋酸鈉緩衝液進行洗滌。在步驟O)中，脫鹽濃縮可以利用超濾膜，優選為截留分子量為1萬的超濾膜進行。優選地，洗脫液被脫鹽濃縮至其電導率與pH值為4 5的0. 05mol/L醋酸鈉緩衝液的電導率相等時為止。在步驟(3)中，優選地，在被加到羧甲基陽離子交換層析柱前，先將脫鹽濃縮的洗脫液的PH值和電導率調節至與pH值為5. 5 6. 5的0. 05 0. lmol/L醋酸鈉緩衝液的pH 值和電導率相等。優選地，步驟(1)、⑵和/或⑶在0 15°C下進行。進一步優選地，上述純化方法還包括向步驟C3)獲得的洗脫液中加入乙醇進行沉澱。更優選地，上述純化方法還包括將沉澱進行脫水和真空乾燥，例如脫水採用無水乙醇進行；真空乾燥為在五氧化二磷存在下的真空乾燥。上述純化方法還包括採用磷酸鈣除去純化的人絨毛膜促性腺激素中的熱原。本發明成功地將兩個陽離子交換樹脂以串聯的方式應用於人絨毛膜促性腺激素 (HCG)的純化中，該純化方法製得HCG效價不低於7000iu/mg的HCG產品，總收率超過90 %。


以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中圖1為通過本發明的純化方法與現有工藝製備的HCG產品的電泳圖譜，從左至右分別為分子量標準品(Marker)、現有工藝1製備的產品、現有工藝2製備的產品、本發明的純化方法製備的產品。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。實施例1起始原料採用單位效價不低於120iu/mg的HCG粗品，該粗品是由孕婦尿液通過苯甲酸鈉吸附、高鹽抽提以及低鹽反抽等方法製得的。純化工藝2. 1層析1 (層析環境為0 15°C )2. 1. 1將500g的HCG粗品用0 15°C、pH值為4 5的0. 05mol/L醋酸鈉緩衝液(平衡液1)溶解，共需40L。2. 1. 2選用20L CM-葡聚糖凝膠層析柱(S印hadex LH-20，美國GE公司)，事先用平衡液1平衡至其流出液的電導和PH值與平衡液1的基本一致。2. 1. 3將溶解好的上樣液按照1 2個柱體積/小時上樣，上樣結束後用平衡液1 洗滌3 4個柱體積，洗滌速度為2 3個柱體積/小時。2. 1. 4用pH值為4 5，包含0. 05mol/L醋酸鈉、0. 2 0. 5mol/L氯化鈉的緩衝液作為洗脫液進行洗脫，洗脫速度2 3個柱體積/小時，收集280nm下光密度為0. 6 0. 7 的洗脫液，一般收集20L。2. 1. 5用截留分子量為1萬的超濾膜對洗脫液進行脫鹽濃縮，至其電導值降至與平衡液1的電導值基本一致為止。2. 2層析2 (層析環境0 15°C ):2. 2. 1選用IL的CM-葡聚糖凝膠層析柱(S印hadex LH-20，美國GE公司)，事先用 PH值為5. 5 6. 5的0. 05 0. lmol/L醋酸鈉緩衝液(平衡液2)平衡好。2. 2. 2將2. 1中經超濾濃縮的洗脫液的pH值和電導率調節至與平衡液2的基本一致。2. 2. 3上CM葡聚糖凝膠層析柱，上樣速度2 3個柱體積/小時，上樣結束後用平衡液2洗滌，洗滌速度為2 3個柱體積/小時，直接收集280nm下光密度為0. 6 0. 7的洗脫液。2. 2. 4洗脫液中加入5倍量的_10°C的藥用酒精進行沉澱，過夜後用離心機(4000 轉/分鐘)進行離心，再用無水乙醇進行脫水，五氧化二磷真空乾燥製得HCG中間體25克。2. 3磷酸鈣除熱原通過磷酸鈣除熱原處理，得到19克HCG產品。實施例2對實施例1純化得到的人絨毛膜促性腺激素HCG產品與通過現有工藝1、現有工藝 2製備得到的產品進行生物效價檢測及電泳實驗，結果如表1和圖1所示。其中，現有工藝1 參照中國專利ZL01805363. 7中所述的方法；現有工藝2 參照中國專利ZL200510110035. 1中所述的方法；生物效價檢測方法如下1.實驗動物SPF級NIH小鼠，雌性，體重9 13g，日齡17 23天。由麗珠集團麗珠製藥廠動物室提供。2.方法取人絨毛膜促性腺激素採用0. 9%氯化鈉溶液為溶媒製成每ImL中含10單位的溶液，再用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液按高、中、低劑量組製成0. 125u/mL、0. 075u/mL、 0. 045u/mL濃度的3種稀釋液作為供試品溶液。取SPF級、體重9 13g、日齡17 23天、 同一來源的雌性NIH小鼠共48隻。其出生日數相差不超過3日，體重相差不超過3g。按照體重隨機分成3組，每組實驗小鼠16隻。每日於大致相同的時間分別給每隻小鼠皮下注入一種濃度的標準品或供試品稀釋液0. 2mL,每日一次，連續注入3次，於最後一次注入24h 後，將動物處死，稱體重，解剖，於陰道和子宮交接處剪斷，摘出子宮，剝離附著的組織，去掉卵巢，壓乾子宮內液，直接稱重(精密至0. 5mg)並換算成每IOg體重的子宮重，照生物檢定統計法(中國藥典附錄X IV)中的量反應平行線測定法計算效價(即中國藥典方法標準品與供試品均採用0. 9%氯化鈉溶液為溶媒製成每ImL中含10單位的溶液後進行效價測定)。電泳實驗如下1.用瓊脂將長玻璃板下端封住，冷凝30分，灌12%分離膠9ml蒸餾水， 6. Oml 30%丙烯醯胺，3. 8ml 1. 5mol/l Tris-HCl, 150 μ 1 10% SDS, 150 μ 1 10%過硫酸銨，6 μ 1 TEMED)，灌到至短玻璃板km，用水封住，冷凝30分後將水倒出，吸乾，灌滿5 %濃縮膠(5. 5ml 蒸溜水，1. 3ml 30 % 丙烯醯胺，1. Oml 1. 5mol/l Tris-HCl，80 μ 1 10% SDS, 80 μ 1 10%過硫酸銨，8 μ 1 TEMED)後立即插入梳子，冷凝30分後取出梳子，將1 X電泳緩衝液倒入電泳槽，並淹沒短玻璃板2.取50mgHCG產品與50ml樣品緩衝液混合，用微量進樣器以10 μ 1的量注入點樣孔，不加樣槽注入樣品緩衝液。3.以濃縮膠中80V，分離膠中120V電壓進行電泳，至距底線Icm時關閉電源
4.將電泳後的凝膠取出，置於培養皿中，用蒸餾水衝去殘留緩衝液，加入染色液將凝膠完全浸泡其中，放入微波爐內，高火檔照射20秒，停留lmin，再照射10秒，反覆幾次至凝膠上色後倒出染色液，用蒸餾水衝去殘留染色液，加入脫色液，高火檔照射20秒，倒出脫色液，再加入新鮮脫色液照射20秒，重複5-6次，直至背景清晰透明，於凝膠分析儀上成像分析。表1本發明的純化方法與現有工藝的生產結果對比
權利要求
1.一種人絨毛膜促性腺激素的純化方法，該純化方法包括以下步驟(1)將人絨毛膜促性腺激素粗品溶解於PH值為4 5的0.05mol/L醋酸鈉緩衝液後， 加到載體為瓊脂糖、葡聚糖凝膠或羥磷酸鈣的羧甲基陽離子交換層析柱上，以PH值為4 5的包含0. 05mol/L醋酸鈉和0. 2 0. 5mol/L氯化鈉的緩衝液洗脫，收集270 ^Onm，優選為280nm下光密度為0. 6 0. 7的洗脫液；(2)將洗脫液脫鹽濃縮；(3)再加到載體為瓊脂糖、葡聚糖凝膠或羥磷酸鈣的羧甲基陽離子交換層析柱上，以 PH值為5. 5 6. 5的0. 05 0. lmol/L醋酸鈉緩衝液洗脫，收集270 ^Onm,優選為^Onm 下光密度為0. 6 0. 7的洗脫液。
2.根據權利要求1所述的純化方法，其特徵在於，在所述步驟(1)中，以PH值為4 5 的包含0. 05mol/L醋酸鈉和0. 2 0. 5mol/L氯化鈉的緩衝液洗脫之前以pH值為4 5的 0. 05mol/L醋酸鈉緩衝液進行洗滌。
3.根據權利要求1或2所述的純化方法，其特徵在於，在所述步驟O)中，所述脫鹽濃縮利用超濾膜，優選為截留分子量為1萬的超濾膜進行。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的純化方法，其特徵在於，在所述步驟(2)中，所述洗脫液被脫鹽濃縮至其電導率與PH值為4 5的0. 05mol/L醋酸鈉緩衝液的電導率相等時為止。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的純化方法，其特徵在於，在所述步驟(3)中，在被加到羧甲基陽離子交換層析柱前，先將脫鹽濃縮的洗脫液的PH值和電導率調節至與pH 值為5. 5 6. 5的0. 05 0. lmol/L醋酸鈉的緩衝液的pH值和電導率相等。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的純化方法，其特徵在於，所述步驟(1)、(2)和/ 或(3)在0 15°C下進行。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的純化方法，其特徵在於，所述純化方法還包括向步驟C3)獲得的洗脫液中加入乙醇進行沉澱。
8.根據權利要求7所述的純化方法，其特徵在於，所述純化方法還包括將沉澱進行脫水和真空乾燥。
9.根據權利要求8所述的純化方法，其特徵在於，所述脫水採用無水乙醇進行；所述真空乾燥為在五氧化二磷存在下的真空乾燥。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的純化方法，其特徵在於，所述純化方法還包括採用磷酸鈣除去純化的人絨毛膜促性腺激素中的熱原。
全文摘要
本發明提供一種人絨毛膜促性腺激素的純化方法，該純化方法包括以下步驟(1)將人絨毛膜促性腺激素粗品溶解於pH值為4～5的0.05mol/L醋酸鈉緩衝液後，加到載體為瓊脂糖、葡聚糖凝膠或羥磷酸鈣的羧甲基陽離子交換層析柱上，以pH值為4～5的包含0.05mol/L醋酸鈉和0.2～0.5mol/L氯化鈉的緩衝液洗脫，收集270～290nm，優選為280nm下光密度為0.6～0.7的洗脫液；(2)將洗脫液脫鹽濃縮；(3)再加到羧甲基陽離子交換層析柱，以pH值為5.5～6.5的0.05～0.1mol/L醋酸鈉緩衝液洗脫，收集270～290nm，優選為280nm下光密度為0.6～0.7的洗脫液。該純化方法製得人絨毛膜促性腺激素效價不低於7000iu/mg的HCG產品，總收率超過90％。
文檔編號C07K1/34GK102485752SQ201010566930
公開日2012年6月6日 申請日期2010年12月1日 優先權日2010年12月1日
發明者萬龍巖, 有洪華, 汪佩華, 王林鵬, 陳一平 申請人:上海麗珠製藥有限公司