一種1-氰基環己基乙酸的製備方法

2023-06-11 16:41:51 2

一種1-氰基環己基乙酸的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種1-氰基環己基乙酸的製備方法，首先採用微生物轉化的方法對底物1-氰基環己基乙腈進行催化，然後採用分步分離的方法對轉化液進行分離純化，最終獲得了蛋白殘留100PPM以下，收率在85％以上，純度達到98％的產物，很好的解決了後續加氫反應生成加巴噴丁時由於蛋白濃度過高對催化劑產生毒害作用的問題，也提高了加巴噴丁的產量。
【專利說明】一種1-氰基環己基乙酸的製備方法 (一）

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種1-氰基環己基乙酸的製備方法，特別涉及利用含重組腈水解酶 的工程菌生物轉化製備1-氰基環己基乙酸的方法。 (二）

【背景技術】
[0002] 1-氰基環己基乙酸（1-cyanocyclohexaneaceticacid)是製備抗癲癇藥物加巴 噴丁的重要中間體。
[0003]加巴噴丁（gabapentin)，化學名稱為1-氨甲基-1-環己基乙酸，別名為卡巴番定、 迭力。其結構與氨基丁酸（GABA)類似，主要用於治療癲癇及多種神經性疼痛，是一種新 型的抗癲癇藥物。常溫下，加巴噴丁為白色或類白色結晶性粉末，無味。分子式為：C9H17N02。 相對分子質量為171. 24,易溶於水，微溶於乙醇，不溶於乙醚。
[0004]加巴噴丁的分子結構比較簡單，既有氨基又有羧基，易脫水形成五元環的螺環內 酯，也是六元環的同一碳原子上帶有兩個取代基。所以，大部分研究者都以六元環化合物為 起始原料。當前工業合成加巴噴丁主要通過化學方法以環己酮、環己基甲醛、亞甲基環己烷 等為原料經過一系列的環化、脫羧、重排、水解等反應最終製得。但是現有路線有很多的問 題：（1)反應條件苛刻，需在強酸、強鹼條件下反應；（2)所用原料毒性較大，操作危險，運輸 困難，易汙染環境；(3)反應時間長，費時費力；(4)反應收率低，影響經濟效益。所以現使用 一條化學酶法合成加巴噴丁的路線。
[0005]加巴噴丁的化學酶法合成路線，是以環己酮為原料，首先製得1-氰基環己基乙 腈，然後再以腈水解酶催化生成1-氰基環己基乙酸，最後通過催化加氫得到加巴噴丁。整 個過程操作方便、對環境友好而且收率高。而1-氰基環己基乙酸是腈水解酶法製取加巴噴 丁過程中最關鍵的中間體。
[0006]化學酶法具有收率高，純度高，副產物少，易操作和環境友好等優點，是一種較為 有效的廉價生產的方法。加巴噴丁化學酶法合成路線的關鍵，是腈水解酶催化1-氰基環己 基乙腈生成1-氰基環己基乙酸，催化完成的生物轉化液中含有大量菌體，以及一些細胞破 裂後流出的細胞液，蛋白質，糖類等雜質。如需進行下一步反應，需先將生物轉化液中的大 量蛋白質等雜質除去。
[0007]現有對1-氰基環己基乙酸的分離提取的技術，還未見其文獻報導。一般對有機羧 酸的提取是通過有機溶劑的萃取，或者膜過濾裝置，或者離子交換層析。 (三）


【發明內容】

[0008]本發明目的是提供一種1-氰基環己基乙酸的分離提取方法，可以快速、有效地將 生物轉化液中的蛋白質等雜質去除，並且擁有較高的收率，便於其進行下一步加氫反應。
[0009]本發明採用的技術方案是：
[0010] 本發明提供一種1-氰基環己基乙酸的製備方法，所述方法為：（1)生物轉化：以腈 水解酶為催化劑，以1-氰基環己基乙腈為底物，以pH值為7. 0的緩衝液（優選PBS緩衝液） 或去離子水為反應介質，在35°C進行轉化反應，反應結束後,獲得轉化液；（2)分離純化：① 將步驟（1)獲得的轉化液調pH值至7. 3?8. 0,離心，獲得上清液和沉澱；②取上清液加入 聚合硫酸鐵，攪拌絮凝，抽濾，獲得濾液a和濾餅a;③向濾液a中加入活性炭，攪拌除色（優 選60°C攪拌30min)，抽濾，獲得濾液c和濾餅c;所述活性炭的質量加入量以濾液a體積計 為0. 001?0. 01g/ml;④將濾液c調節pH值為2. 0?2. 5,靜置沉澱，抽濾，獲得濾餅e和 濾液e，將濾餅e乾燥，獲得1-氰基環己基乙酸。

【權利要求】
1. 一種1-氰基環己基乙酸的製備方法，其特徵在於所述方法為：（1)生物轉化：以腈 水解酶為催化劑，以1-氰基環己基乙腈為底物，以pH值為7. 0的緩衝液或去離子水為反應 介質，在35°C進行轉化反應，反應結束後，獲得轉化液；(2)分離純化：①將步驟（1)獲得的 轉化液調pH值至7. 3?8. 0,離心，獲得上清液和沉澱；②取上清液加入聚合硫酸鐵，攪拌 絮凝，抽濾，獲得濾液a和濾餅a ;③向濾液a中加入活性炭，攪拌除色，抽濾，獲得濾液c和 濾餅c ;④將濾液c調節pH值為2. 0?2. 5,靜置沉澱，抽濾，獲得濾餅e和濾液e，將濾餅e 乾燥，獲得1-氰基環己基乙酸。
2. 如權利要求1所述1-氰基環己基乙酸的製備方法，其特徵在於所述催化劑的質量濃 度為2. 5?50g/L反應介質，底物的初始濃度為lmol/L反應介質。
3. 如權利要求1所述1-氰基環己基乙酸的製備方法，其特徵在於所述步驟②具體為： 取上清液加入終濃度3?5g/L聚合硫酸鐵，在20?30°C、200rpm條件下攪拌l-10min，然 後再在30°C、50rpm條件下攪拌5-30min，4°C下靜置沉降20-60min，抽濾，獲得濾液a和濾 餅a。
4. 如權利要求1所述1-氰基環己基乙酸的製備方法，其特徵在於所述腈水解酶為含 腈水解酶突變體的工程菌經發酵培養獲得的溼菌體，所述含腈水解酶突變體的工程菌按如 下方法獲得：（1)以敏捷食酸菌（Acidovorax facilis)ZJB09122基因組DNA為模板，以序 列1和序列2為引物，通過PCR方法獲得含重組腈水解酶基因的克隆載體；然後再以含重 組腈水解酶基因的克隆載體為模板，以序列3和序列4為引物，使用高保真的DNA聚合酶擴 增目標腈水解酶基因，運用酶切連接的方法，構建了含重組腈水解酶基因的表達載體；序列 1 :5, -ATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3，，序列 2 :5, -CTACTTTGCTGGGACCGG-3，， 序列 3 :5'-AATGGATCCATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3' 序列 4 :5' -AGGGTCGACCTACTTTGCTG GGACCGG-3,； (2)以步驟（1)構建的含重組腈水解酶基因的表達載體為模版，以序列5和序列6為引 物，根據Quikchange定點突變方法，擴增得到含重組腈水解酶突變體的表達載體，並將突 變表達載體轉化至宿主菌，得到含腈水解酶突變體的工程菌； 序列 5 :5' -GAGCACGTTCAGCCGCTGTCCAAAT-3，； 序列 6 :5' -CGGCTGAACGTGCTCCCAGCAGTTC-3'。
5. 如權利要求1所述1-氰基環己基乙酸的製備方法，其特徵在於所述聚合硫酸鐵的加 入量為3?5g/L。
6. 如權利要求1所述1-氰基環己基乙酸的製備方法，其特徵在於所述③中將濾餅a用 蒸餾水洗滌，抽濾，獲得濾餅b和濾液b，將濾液b和濾液a合併後加入活性炭；所述活性炭 的質量加入量以濾液a和濾液b總體積計為0. 001?0. 01g/ml。
7. 如權利要求1所述1-氰基環己基乙酸的製備方法，其特徵在於所述④中將濾餅c用 蒸餾水洗滌，抽濾，獲得濾餅d和濾液d，合併濾液c和濾液d並調節pH值為2. 0?2. 5。
8. 如權利要求4所述1-氰基環己基乙酸的製備方法，其特徵在於所述溼菌體按如下步 驟製備： (1)斜面培養 將含腈水解酶的工程菌或含腈水解酶突變體的工程菌接種至斜面培養基，30°C培養 24h，獲得菌體斜面；斜面培養基終濃度組成為：酵母粉5g/L，胰蛋白腖10g/L，NaCl 10g/L， 瓊脂30g/L，溶劑為去離子水，pH值自然； (2) 種子培養 從菌體斜面挑取一接種環菌體接種至種子培養基，37°C培養10h，獲得種子液；種子培 養基終濃度組成為：酵母粉5g/L，胰蛋白腖10g/L，NaCl 10g/L，卡納黴素50mg/L，溶劑為去 離子水，pH值自然； (3) 發酵培養 將步驟（2)獲得的種子液以體積濃度2%的接種量接種至發酵罐，37°C發酵培養4h後， 降溫至30°C，添加終濃度10g/L乳糖進行誘導，誘導培養至0D值達到25-40,停止發酵，發 酵過程中pH維持在6. 5,取發酵液離心，得到溼菌體；發酵培養基每3L組成為：蛋白腖45g、 酵母粉36g、NaC130g、甘油36g、磷酸二氫鉀4. 08g、磷酸氫二鉀6. 84g、硫酸鎂1. 125g、硫酸 銨15g，溶劑為去離子水，pH值為6. 5。
9. 如權利要求1所述1-氰基環己基乙酸的製備方法，其特徵在於步驟（2)分離純化方 法為：①將步驟（1)獲得的轉化液調pH值至7. 3?8. 0,離心，獲得上清液和沉澱；②取上 清液加入無水乙醇，在20?30°C、200rpm條件下攪拌lh，抽濾，獲得濾液A和濾餅A ;將濾 液A在35°C減壓濃縮至無液體流出，獲得濃縮液；③使用去離子水將濃縮液定容至濃縮前 體積，再加入活性炭，60°C攪拌30min，抽濾，獲得濾液B和濾餅B，將濾餅B用蒸餾水洗滌， 抽濾，獲得濾餅C和濾液C ;所述活性炭的質量加入量以定容後濃縮液體積計為0. 001? 0. 01g/ml ;④合併濾液B和濾液C並調節pH值為2. 0?2. 5, 20?30°C靜置沉澱，抽濾，獲 得濾餅D和濾液D，將濾餅D乾燥，獲得1-氰基環己基乙酸。
10. 如權利要求9所述1-氰基環己基乙酸的製備方法，其特徵在於無水乙醇體積加入 量是上清液體積的1. 5-4倍。
【文檔編號】C12P13/00GK104342463SQ201410395025
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年8月12日 優先權日:2014年8月12日
【發明者】鄭裕國, 薛亞平, 柳志強, 蘇新瑞, 黃有明, 翁建峰, 王應鵬, 賈東旭 申請人:浙江工業大學