靶向惡性腦瘤的功能化樹狀大分子基因載體系統的製作方法
2023-06-11 22:32:01
專利名稱：靶向惡性腦瘤的功能化樹狀大分子基因載體系統的製作方法
靶向惡M瘤的功能化樹狀大M基因載體系統
fe^領域I本發明屬於生物醫藥技術領域，特別涉及耙向惡'M瘤基因傳遞並對惡'M瘤進fi1 治療的功能化樹狀大^T基因載體系統。
背景獄惡SM瘤是極具危害的顱內腫瘤，從肝生物學和細胞生物學的原理和角度，它是
一類以細胞惡性增殖為基本特徵的疾病，往糹iS浸潤性生長，無明顯界限，手術船隹完全切除。 與全身各系鄉中瘤相比，惡ffiif瘤患者自出現症輕死亡的平均期限不及半年，手術加放療的平 均存活期未逾~￥。採用手術、放療、化療綜合治療，惡1 ^腦生存率1年為45%、 2年20%。 腦臓瘤細胞動力學表明若手術切除99%的腫瘤，8周後腫瘤細胞則可恢復到原微目，為改善 惡幽中瘤的予販，迫ftX們探索新的治療途徑。
腫瘤的基因治療^ffl過向腫瘤細胞中引入功能性基因，調控細胞內信號轉導及蛋白表達，達 至柳帝鵬瘤細胞增殖的目的，這已成為當前腫瘤治療研究的熱點之一。在過去的十多年中，大量
試劑棚於體外細胞培養中，以增3SM粒DNA、反義核酸等遺4彌質的轉染效率。這對式劑包括 陽離子脂複合物、多膚、表面活性劑、月旨質體及其它試劑等。它們在許多方面優於病毒載體，如 無免疫原性、無潛在的感染危險，以及妒方法簡單易行。但這些試劑的轉染效率通常不如腺病 ^^S組載體，因此明顯限制其i頓。
對於惡'M瘤的治療，基因治療還存在體內傳遞的障礙，由於jfiLfi屏障的存在，常規的基因 載體體內注射後難於傳避鵬內，因此開發功能化的基因載體，使基因被介導i!3llfiL腦屏障並耙
向於腫瘤，是腦瘤治療體內基因傳遞的首要問題。
發明內容本發明目的是樹共一種可以實現體內腫瘤細胞的靶向和瘤細胞內基因的高效轉染，
有J娜制腫瘤生長的靶向惡',瘤的功能化樹狀大肝基因載體系統。
本發明衝共的靶向惡m瘤的功能化樹狀大肝基因載體系統是以,蛋白、織蛋白單克
隆抗體或多克隆抗體、葉酸、表皮生長因子受,克隆抗體或多克隆抗體、RGD環肽中的一種或 多種的組合為靶向性功能因子，化學聯擬附狀大肝聚,-胺(PAMAM)載體上，再與治療 因子寡+維酸、siRNA肝頗粒DNA複合後製得，靜敗湖啦體定位注射後可以實現體內腫
瘤細胞的耙向和瘤細胞內基因的高效轉染，有 娜制腫瘤生長。
戶;M的聚itK-i^體是聚,安-胺樹狀^，其ftm為3 7代。
本發明戶腐的基因載體系^^3i以下步麟喊
第一、取1 100M份數的靶向性功能因子溶解於緩衝溶液中，fc甲基亞碸中，配^Si 濃度為0.01~90%的溶液，得溶液A;
第二取i ioo重量份數的聚ma安-胺溶解於去離子水，或緩衝溶液，或有機溶劑中，鵬重
量濃度為0.01~90%的溶液，得溶液B;.
第三、取0.05-500重量份數的EDC[l-[3-(dimethylamino) propyl]-3"ethylcarbodiimide HC1溶於 緩衝溶液中，Sfii^i濃度為0.01~90%的溶液，得溶液C;
第四、在-2(TC 8(TC^f牛下，將溶液A與溶液B混合均勻，逐步滴加溶液C，反應0.5~72
小時；
第五、將上步反應^對7K5t析後冷凍千燥，得到靶向惡鵬瘤的功能化樹狀大肝基因載
體；
第六、取1-100重量份數的第五頻幌的耙向惡'M瘤的功能化樹狀大^基因載,解於 緩衝溶液中，加入1~64重量份數的治療因子，渦流震蕩1~1200粥中，得到耙向惡,瘤的功能 化樹狀大好基因載體系統。
臓的緩衝溶液為生 7尺、磷酸陽磷鵬緩衝溶液、氯化鈉-鹽酸緩衝溶液、Tris緩衝溶液或 碳,-碳隨鈉緩衝溶fc
用於聚醐安-胺溶解的有機蹄偽甲醇、乙醇或丙酮。
所述的靶向性功能因子是,蛋白、,蛋白單克隆抗體或多克隆抗體、葉酸、表皮生長因 子受,克隆抗體或多克隆抗體、RGD環肽中的一種或兩種以上的組合；所丞的聚 -胺載體是 聚翻安-胺樹狀分子，其代數為3 7代；所述的治療因子是治療性鎌苷酸、質粒DNA或siRNA 分子。
本發明的優點和積極鄉
本發明掛共的靶向惡fete瘤的功能化樹狀大好基因載體系統，艦埋植、立體定位注射、 靜詠注射和頸動脈注射，可以體內靶向於惡ttfi瘤細胞，並實現基因在瘤細胞中的高效轉染，達 到良好的治療效果。
與商業化的基因載體Oligofectamin和未糹Slf,的PAMAM相比，FA-PAMAM在體內夕卜均 倉腿著的提高基因的靶向性鵬能力。
圖1是不同功能化載粘寡蹄酸複合後的謝電子顯微境照片;圖中，入未改性的PAMAM 為密實的實心球體，粒子分布均勻，粒徑大小經過透射電鏡標準尺寸測雖得出其值在50nm 左右；B，葉酸修飾後並不改變PAMAM的基本形繊徵和粒子大小，粒子仍實心球體，分布 較均勻，粒徑大小經過透射尺寸標準(表2-l)測量換算後得出其值也在50nm左右；C,在 N/P比為32:1時，與單純的載體粒子相比，復，粒子的形繊徵仍未勝改變，粒子分布 均勻，粒徑大小在60-80nm，此時的照片襯度很高，粒子呈密實的小球狀；D,在N/P比為32:1 時，複合物粒子的形態特徵與N/P比為16:1時相同，不同的艦時照片的襯度很低；E在N/P 比為64:1時，複合物粒子的形態呈現出各種的自聚集結構，在我們拍擬啲圖中，64:l的FA-PAMAM/ODN 復，呈現為簇狀束， 64:l的PAMAM/ODN複合物分子則為扇形組裝結構； 圖2影就細胞儀檢測不同載體系統的轉染效萄ODN由FITC標記)，圖中，A為空白鎌 苷酸，B為寡聚脂質體轉染寡核苷酸，C為樹狀大分子聚醯胺-胺轉染寡核苷酸，D為葉酸-樹 狀大肝聚醯胺-胺轉染寡核苷酸； 圖3是荷瘤鼠生，分析；
圖4是MRI動態檢測動物模型的生長狀況(上對照組大鼠顱內腫瘤強化MRI， A為一周後，
B為兩周後；下治療組大鼠顱內腫瘤強化MRI， C為一周後，D為兩周後，E為三周後)；
圖5是FA-PAMAM/ODN、 PAMAM/ODN、 Oligofectamin/ODN和裸ODN靜脈注射24小時 後體內組織，官分布。
本發明提供的具有體內靶向BW瘤的功能化樹狀大分子基因載體系統包括
(一) 、靶向惡性瘤的功能化樹狀大分子基因載體的製備
(二) 、基因載粘治療因子(治療性基因)複合，制錢因載體系統
(三) 、惡腿瘤基因治療駄
技術方案l:以荷C6膠質瘤大鼠為動辦莫型，按功能化載體所載基因重量與動物重量比1:
IO(MOOOO稱取功能化載體與治療性基因復^j，頸動E^lt洽療惡'M瘤。
技術方案2:以荷C6皿瘤大鼠為動辦IM，按功能化載體所,因《與動 *比1:
10(M國稱取功能化載體與治療性基因復，，靜脈激治療惡'W瘤。
技術方案3:以荷C6，瘤大鼠為動辦難，按功能化載體所,因M與動tM比l-
IO(MOOOO稱取功能化載體與治療性基因復^/， ^^瘤瘤腔內立體定位注射治療惡I4H瘤。
實施例l
(1) lmg葉酸溶於lmL二甲基亞碸中，得溶液A。 (2) 10mg聚醐安-胺5代樹狀大肝溶 於lmL去離子水中，得溶液B。 (3) 3mgEDC溶解於lmL碳M-碳WL鈉緩衝溶液中，得溶液C。 室溫下將溶液A與溶液B混合均勻，逐步滴加溶液C，反應4小時。將i^反lS^tl對7Kii析後 冷凍千燥，得葉酸改性的聚醐安-胺基因載體。其鄉電子顯微鏡照片如圖la。 (4)將葉酸改性的 聚醐安-胺與l,25mg寡核苷酸，渦^M蕩10併中，得到含有耙向惡鵬瘤的功能化樹狀大肝基 因載體系統的溶液D。 (5)將溶液0過0.22膜，尾靜脈ait至C6荷瘤鼠，24小時後體內分布如 圖5。 (6)將溶液0過0.22膜，瘤腔內定位艦，荷瘤鼠生存期如圖3，其MRI動態檢測動物腫 瘤生長狀況如圖4。 實施例2
所用聚鵬-胺為3代樹狀大肝，其它同M例1 實施例3
所用聚翻安-胺為7f^狀大M,其它同實施例l 實施例4
(1) O.lmgRGD環肽溶於lmL二甲基亞碸中，得溶m。 (2) lmg聚mS安-胺5ftW狀大肝溶 於lmL去離子水中，得溶細。(3)0.3mgEDC溶解於lmL碳,^a戱鈉緩衝溶液中，得溶液C。 室溫下將溶a與溶自混合均勻，逐步滴加溶液C，反應4小時。將J^反應^對zK3t析後冷凍 千燥，得RGD改性的聚鵬-胺基因載體。(4)將RGD改性的聚itl^胺與0.125mg寡核苷酸，渦流 震蕩10分鐘，得到含有耙向惡'm瘤的功能化樹狀大W基因載體系統的溶^D。 (5)將溶 過
0.22膜，尾靜除，至C6荷瘤鼠，或瘤腔內定位Slt，荷瘤鼠生^^有 iM著延長。 實施例5
(1) 0.06mgRGD環肽和0.04g葉麟溶於lmL二甲基亞碸中，得溶船。(2) lmg聚,-胺5 代樹駄肝溶於lmL去離子水中，得溶細。(3) 0.3mg EDC溶解於lmL碳,-碳隨鈉緩衝溶 液中，得溶液C。室溫下將溶m與溶細混合均勻，逐步滴加溶液C， ^Z4小時。將戰鵬產 物對7X3S析後冷凍千燥，得RGD和葉酸雙功能改性的聚自-ra因載體。(4)將RGD和葉酸雙功 能改性的聚醐安-胺與0.125mg siRNA，渦流震蕩10射中，得到含鞭向惡鵬瘤的功能化樹狀大 M基因載體系統的溶^D。 (5)將溶船過0.22膜，尾靜詠皿至C疏瘤鼠，或瘤腔內定位,， 荷瘤鼠生存期有艦著延長。 實施例6
(1) 10§織蛋白溶刊.51111磷酸-磷離緩衝溶液(PBS)中，得溶船。 (2) 0.5mg聚Sti安 -胺樹狀大肝溶於lmLPBS緩衝溶液中，得溶細。(3)0.5mg EDC溶解於0,5mL去離子水中，得溶 液C。室溫下將溶a與溶細混合均勻，逐步滴加溶液C，反應4小時。將Jb^反j^物aSephdex50 柱後冷凍千燥，得繊蛋白改性的聚鵬-胺基因載體。其翻電子顯微^ 、片如圖lb。 (4)將織 蛋白改性的聚mK-胺與O.lmg寡核苷酸，渦流震蕩10射中，得含WIE向惡M瘤的功能化樹狀大分 子基因載體系統的溶娜。(5)將溶艦過0.22膜，尾靜脈注射至C6荷瘤鼠，熒腿微^M察發現 腫瘤內有明顯寡核苷酸存在。(6)將溶 過0.22膜，瘤腔內定位注射，荷瘤鼠平均生存期延長至 27±3.2天，與對照組相比生#^顯著延長。 實施例7
所用的功能化耙向因子為,蛋白單克隆抗體， 步驟如 例6,尾靜敗a^f至C6荷瘤鼠， 螢光顯微鏡觀察發現腫瘤內有明顯寡核苷酸存在；瘤腔內定位注射，荷瘤鼠平均生存期延長至 24±2.5天，與對照組相比生存期顯著延長。 實施例8
所用的功能化耙向因子為微蛋白多克隆抗體.，鄉步驟如實施例6，尾靜詠注射至C満瘤鼠，
螢光顯微鏡觀察發現腫瘤內有明顯寡核苷酸存在；瘤腔內定位注射，荷瘤鼠平均生存期延長至 27±2.7天，與對照組相比生糊顯著延長。 實施例9
所用的功能化耙向因子為表皮生長因子受體單克隆抗體，實施步驟如實施例6，尾靜脈注射至
C6荷瘤鼠，螢光顯微鏡發現腫瘤內有明顯寡核苷酸存在；瘤腔內定位注射，荷瘤鼠平均生存 期延長敦7士3.4天，與對照組相比生存期顯著延長。' 實施例１０
所用的功能化耙向因子為表皮生長因子受體多克隆抗體，實施步驟如實施例6，尾靜脈注射至 C6荷瘤鼠，螢光顯微鏡觀察發測中瘤內有明顯寡核苷酸存在；瘤腔內定位注射，荷瘤鼠平均生存 期延長至30±2.7天，與對照組相比生存期顯著延長。
權利要求
1、一種靶向惡性腦瘤的功能化樹狀大分子基因載體系統，其特徵在於該基因載體系統是以聚醯胺-胺為載體，與靶向性功能因子化學偶聯後，與治療因子物理結合製成。
2、 根據權利要求1臓的靶向惡鵬瘤的功能化樹狀大好基因載體系統，辦徵在於所 述的靶向性功能因子是,蛋白、轉鐵蛋白單克隆抗體或多克隆抗體、葉酸、表皮生長因子受體 單克隆抗體或多克隆抗體、RGD環肽中的一種或兩種以上的組合。
3、 根據權利要求1所述的靶向惡行腦瘤的功能化樹狀大肝基因載體系統，其特徵在於所 述的聚,-胺載體是聚醯胺-胺樹狀分子，其代數為3~7代。
4、 根據權利要求1所述的靶向惡性腦瘤的功能化樹狀大好基因載體系統，其特徵在於所 述的治療因子是治療性寡核苷酸、質粒DNA或siRNA。
5、 一種權利要求1所述的靶向惡性腦瘤的功能化樹狀大分子基因載體系統的製備方法，其 特徵在預方法紐以下步驟製成第一、取l 100重量份數的耙向性功能因子溶解於緩衝溶液中，或二甲基亞碸中， 濃度為0.01~90%的溶液，得溶液A;第二取1 100重量份數的聚醯胺溶解於去離子7K，緩衝溶液，或二甲基亞碸中，配成重量濃度為0.01 90%的溶液，分離液B;第三、取0.05~500重量份數的EDC[l-[3-(dimethylamino) propyl]-3ethylcarbodiimide HC1溶於 緩衝溶液中，配 量濃度為0.01~90%的溶液，得溶液C;第四、在-20。C 80C條件下，將溶液A與溶液B混合均勻，逐步滴加溶液C，反應0.5 72小時；第五、將上步反應,詠爐析後冷凍千燥，得到耙向惡,瘤的功能化樹狀大肝基因載體；第六、取1 100重量份數的第五頻幌的靶向惡,瘤的功能化樹狀大肝基因載鵬解於 緩衝溶液中，加入1~64 重量份數的治療因子，渦流震蕩1~1200併中，得到靶向惡,瘤的功能 化樹狀大肝基因載體系統。
6、 根據權利要求5所述的製備方法，期寺徵在於各種過程中所用的緩衝溶液為生SSfe水、 磷酸-磷離緩衝溶液、氯化鈉隱鹽酸緩衝溶液、Tris緩衝溶液碳,-碳縫鈉緩衝溶液。
7、 根據權利要求5臓的製備方法，辦徵在於用於聚ma安-胺溶解的有機翻偽甲醇、乙醇或丙酮。
8、 根據權利要求5、 6或7所述的製備方法，其特徵在於所述的靶向性功能因子是轉鐵蛋白、 ,蛋白單克隆抗體或多克隆抗體、葉酸、表^長因子受,克隆抗體或多克隆抗體、RGD環 肽中的一種或兩種以上的組合；所述的聚醯胺-胺載體是聚醯胺-胺樹狀肝，其代數為3 7代；所 述的治療因子是治療性寡核苷酸、質粒DNA或siRNA分子。
全文摘要
一種靶向惡性腦瘤的功能化樹狀大分子基因載體系統。本發明提供的靶向惡性腦瘤的功能化樹狀大分子基因載體系統是以轉鐵蛋白、轉鐵蛋白單克隆抗體或多克隆抗體、葉酸(FA)、表皮生長因子受體單克隆抗體或多克隆抗體、RGD環肽中的一種或多種的組合為靶向性功能因子，化學聯接到樹狀大分子聚醯胺-胺(PAMAM)載體上，再與治療因子寡核苷酸、siRNA分子或質粒DNA複合後製得，通過瘤腔內定位注射、頸動脈注射或尾靜脈注射，可提高基因在惡性腦瘤內的分布，並可高效表達，對腫瘤實現有效抑制。與商業化的基因載體Oligofectamin和未經過修飾的PAMAM相比，FA-PAMAM在體內外均能顯著的提高基因的靶向性投遞能力。
文檔編號A61P35/00GK101337076SQ200810145690
公開日2009年1月7日 申請日期2008年8月13日 優先權日2008年3月4日
發明者原續波, 康春生, 菲 李, 浦佩玉, 躍 鍾 申請人:天津醫科大學總醫院