一種定量檢測卡的製作方法

2023-06-11 09:04:46

本實用新型涉及微流控技術和免疫螢光技術相結合的技術領域，具體涉及一種定量檢測卡。

背景技術：

近年來因自身免疫障礙而導致的不孕問題越發引起人們的重視，抗精子抗體(AsAb)是免疫性不孕最常見的一種因素。抗精子抗體(AsAb)是一個複雜的病理產物，其作用主要表現為精子凝集、精子制動，影響精子的運送，抑制精子穿透宮頸黏液，限制精子與卵透明帶粘附，抑制精子頂體的活性，使精子不易穿透包繞卵細胞的放射冠和透明帶，阻礙精子與卵細胞膜的融合，阻止精子與卵子結合等。

微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸為數十到數百微米)處理或操縱微小流體(體積為納升到阿升)的一種技術。當微通道的特徵尺寸在微米甚至納米量級時，微通道表面積與其內部空間的體積之比很大，通道的結構、形狀和壁面性質都將對其中的流體流動狀態產生極大的影響。流體在微流控的微通道中具有獨特的流體性質，如層流和液滴等。藉助這些獨特的流體現象，微流控可以實現一系列常規方法所難以完成的微加工和微操作。

免疫螢光技術(Immunofluorescence technique)是免疫學方法(抗原抗體特異結合)與螢光標記技術結合，使用螢光微球標記已知的抗原或抗體，再用這種螢光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原(或抗體)。在檢測過程中，採用螢光微球最佳激發光源進行激發，發射出的螢光經過濾光片後，用CCD掃描技術或光纖技術，將發射光譜收集、聚集和倍增後，轉換成數值信號，實時檢測螢光變化曲線。

目前市面上抗精子抗體檢測試劑盒多採用酶聯免疫吸附法和淺盤凝集法，這些方法尚存在以下方面的不足：

酶聯免疫吸附法是採用正常精子膜抗原包被反應板，加待測標本及酶標記二抗底物顯色，陽性為明顯黃色，陰性孔不顯色。此方法操作複雜，且影響因素較多，檢測結果易受外界因素的幹擾。

淺盤凝集法是將微量正常精子與待測標本在淺盤中混合，鏡下觀察有無凝集。有活動的凝集精子為陽性。此方法靈敏度低，且較易受到外界因素的幹擾。

以上兩種傳統方法均是定性或半定量的檢測方法，無法檢測到血液中抗精子抗體的含量水平。

技術實現要素：

針對以上現有技術問題，本實用新型的目的在於提供一種定量檢測卡，使用的螢光微球不受外界環境的影響，因而螢光穩定，而且通過微流控技術控制待測血液在檢測卡上的流速，為定量檢測提供了良好的條件。採用微流控技術和免疫螢光技術製成包括覆有濾紙的加樣區、噴塗螢光微球標記的抗精子二抗的結合區、微通道、包被有抗精子二抗並具有特殊結構的檢測區和廢液區的抗精子抗體定量檢測卡。具體技術方案如下：

一種定量檢測卡，包括底卡和面卡，其中，所述底卡上設有加樣區，結合區，微通道，檢測區以及廢液區，所述加樣區連接結合區且加樣區與結合區位於微通道的一端，所述檢測區連接廢液區且位於微通道的另一端；所述面卡上設有加樣孔和檢測孔，所述底卡和面卡的背面扣合連接。

所述面卡上的加樣孔所處位置對應於底卡上加樣區的位置，所述面卡上的檢測孔所處位置對應於底卡上檢測區的位置。

所述結合區和檢測區分別設置於微通道的兩端並直接連接至微通道。

所述加樣區覆有濾紙，所述結合區噴塗螢光微球標記的抗精子二抗，所述檢測區包被有抗精子二抗並具有特殊結構微通道。

所述濾紙直徑1.5cm、孔徑為1-3μm，所述微通道通過軟光刻技術製成，寬度為5μm。

所述面卡上的加樣孔連通至底卡上加樣區，所述面卡上的檢測孔連通至底卡上檢測區。

上述抗精子抗體定量檢測卡的製作方法，包括如下步驟：

(1)製作底卡模板；

(2)製備螢光微球標記的抗精子二抗；

(3)噴塗螢光微球標記的抗精子二抗；

(4)包被抗精子二抗；

(5)粘覆濾紙粘覆；

(6)製備完成抗精子抗體定量檢測卡。

進一步地，步驟(1)中，採用聚二甲基矽氧烷材質，利用光刻機設備，經過CAD製圖、掩模、光刻、再鑄模、軟光刻工藝過程來完成底卡模板的製作，其中微通道為5μm；和/或，步驟(2)中，通過聚苯乙烯微球的合成、微球染色、螢光微球標記，將螢光微球標記在抗精子二抗上；和/或，步驟(3)中，用噴金機將螢光微球標記的抗精子二抗按照5μl的量均勻噴塗至底卡模板的結合區；和/或，步驟(4)中，用0.01M PBS調節抗精子二抗的濃度為0.6mg/ml，將所得的溶液按照2μl的量均勻噴塗在底卡模板的檢測區；和/或，步驟(5)中，將直徑為1.5cm、孔徑為1～3μm的圓形濾紙粘覆在底卡模板的加樣區；和/或，步驟(6)中，將面卡和製備好的底卡按合，壓緊。

上述抗精子抗體定量檢測卡的使用方法，包括如下步驟：

a.取1mg製備的螢光微球加入90μl 50mg/ml對乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺(EDC)，150μl 5mg/ml氮經基唬拍酞亞胺(NHS)，振蕩混勻，室溫孵育30min；

b.離心；

c.沉澱用0.01M的硼酸鹽緩衝液溶解，並調節微球濃度為OD450為0.6；

d.將0.1ml螢光微球中加入6μl抗精子二抗，充分混勻後，室溫攪拌反應3h；

e.用超純水洗滌離心3次；

f.沉澱用0.01M的PBS溶液復溶沉澱至起始體積後，即為螢光微球標記的抗精子二抗。

進一步地，步驟b中1000×g離心15min，步驟c中硼酸鹽緩衝液pH為4.8，調節螢光微球的濃度為OD450是0.6，步驟f中PBS溶液為磷酸鹽緩衝液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20。

與目前現有技術相比，本實用新型檢測過程中，採用螢光檢測儀實時檢測螢光微球在最佳激發光源的激發下所發出的螢光數值，測出螢光變化曲線，對照其標準曲線，取兩點螢光值所對應的抗精子抗體的標準濃度值，通過公式即可換算出待測血清中抗精子抗體的含量。本實用新型靈敏度高、操作簡便、穩定且定量準確。

具體來說：

1、本實用新型採用螢光微球標記抗精子二抗。螢光微球是一種載有螢光分子的功能性微球，有比較穩定的形態結構及發光行為，故而不易受到外界因素的幹擾。

2、本實用新型採用微流控技術和免疫螢光技術，通過5μm的微通道控制待測血液在檢測卡上的流速，加上螢光微球穩定高效的發光效率，定量檢測待測血液中抗精子抗體的含量。

3、本實用新型採用檢測卡形式，只需滴一滴待測血液即可完成檢測，操作簡便，靈敏度高。

附圖說明

圖1是抗精子抗體定量檢測卡的底卡結構示意圖；

圖2是抗精子抗體定量檢測卡的面卡結構示意圖。

具體實施方式

下面根據附圖對本實用新型進行詳細描述，其為本實用新型多種實施方式中的一種優選實施例。

在一個優選實施例中，一種定量檢測卡，包括底卡和面卡，其中，底卡上設有加樣區11，結合區12，微通道13，檢測區14以及廢液區15，加樣區11連接結合區12且加樣區11與結合區12位於微通道13的一端，檢測區14連接廢液區15且位於微通道13的另一端；面卡上設有加樣孔21和檢測孔22，底卡和面卡的背面扣合連接。

面卡上的加樣孔21所處位置對應於底卡上加樣區11的位置，面卡上的檢測孔22所處位置對應於底卡上檢測區14的位置。

結合區12和檢測區14分別設置於微通道13的兩端並直接連接至微通道13。

加樣區11覆有濾紙，結合區12噴塗螢光微球標記的抗精子二抗，檢測區14包被有抗精子二抗並具有特殊結構微通道。

濾紙直徑1.5cm、孔徑為1-3μm，微通道13通過軟光刻技術製成，寬度為5μm。

面卡上的加樣孔21連通至底卡上加樣區11，面卡上的檢測孔22連通至底卡上檢測區14。

優選地，一種抗精子抗體定量檢測卡是採用聚二甲基矽氧烷(也稱矽酮彈性體或矽橡膠，PDMS)材質製成，由底卡和面卡組成，底卡構造包括覆有濾紙的加樣區11、噴塗螢光微球標記的抗精子二抗的結合區12、微通道13、包被有抗精子二抗並具有特殊結構微通道的檢測區14和廢液區15，面卡包含加樣孔和檢測孔，面卡構造包括加樣孔21和檢測孔22。

底卡構造中加樣區粘覆有濾紙，濾紙直徑1.5cm、孔徑為1～3μm，底卡構造中包含通過軟光刻技術製成的微通道，微通道為5μm，底卡中結合區噴塗螢光微球標記的抗精子二抗，底卡中檢測區帶有彎型通道的特殊結構。

一種抗精子抗體定量檢測卡是採用一種螢光微球標記抗精子二抗的方法：取1mg製備的螢光微球加入90μl 50mg/ml對乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺(EDC)，150μl 5mg/ml氮經基唬拍酞亞胺(NHS)，振蕩混勻，室溫孵育30min後，1000×g離心15min，沉澱用0.01M的硼酸鹽緩衝液(pH4.8)溶解，並調節微球濃度為OD450為0.6。將0.1ml螢光微球中加入6μl抗精子二抗，充分混勻後，室溫攪拌反應3h，分別用超純水洗滌離心3次後，沉澱用0.01M的PBS溶液(磷酸鹽緩衝液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)復溶沉澱至起始體積後，即為螢光微球標記的抗精子二抗。

調節螢光微球的濃度為OD450是0.6，0.1ml螢光微球中加入6μl抗精子二抗。

在另一個優選實施例中，可以採用如下方案：一種抗精子抗體定量檢測卡，通過抗精子抗體定量檢測卡的底卡模板的製作、螢光微球標記的抗精子二抗的製備、包被抗精子二抗、濾紙粘覆、抗精子抗體定量檢測卡的製備等步驟完成抗精子抗體定量檢測卡的製作，具體包括以下步驟：

抗精子抗體定量檢測卡的底卡模板的製作：採用聚二甲基矽氧烷(PDMS)材質，利用光刻機設備，經過CAD製圖、掩模、光刻、再鑄模、軟光刻等工藝過程來完成底卡模板的製作，微通道為5μm。

螢光微球標記的抗精子二抗的製備：通過聚苯乙烯微球的合成、微球染色、螢光微球標記，將螢光微球標記在抗精子二抗上。

噴塗螢光微球標記的抗精子二抗：用噴金機將螢光微球標記的抗精子二抗按照5μl的量均勻噴塗至底卡模板的結合區。

包被抗精子二抗：用0.01M PBS(磷酸鹽緩衝液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)調節抗精子二抗的濃度為0.6mg/ml，將所得的溶液按照2μl的量均勻噴塗在底卡模板的檢測區。

濾紙粘覆：將直徑為1.5cm、孔徑為1～3μm的圓形濾紙粘覆在底卡模板的加樣區。

抗精子抗體定量檢測卡的製備：將面卡和製備好的底卡按合，壓緊，再將組裝好的檢測卡裝入鋁箔袋中，加入乾燥劑後封口保存，與室溫乾燥環境下可保存一年。

通過微通道控制待測樣品的流速，再利用免疫螢光技術實時檢測螢光變化曲線，再根據一定時間內螢光變化值換算待測樣品中抗精子抗體的濃度水平值。

製作方法優選實施例：

一、抗精子抗體定量檢測卡的底卡模板的製作

本實用新型檢測卡的底卡是採用聚二甲基矽氧烷(PDMS)材質，利用光刻機設備，經過CAD製圖、掩模、光刻、再鑄模、軟光刻等工藝過程來完成底卡模板的製作，微通道為5μm。

二、螢光微球標記的抗精子二抗的製備

1、聚苯乙烯微球的合成

將乙醇50ml和分散劑聚乙烯吡咯烷酮1.80g置於100ml圓底燒瓶中，攪拌成均相體系。引發劑偶氮二異丁腈0.24g和單體苯乙烯12.00g混合併超聲振蕩溶解，通氮氣條件下加入到圓底燒瓶中，保持70℃條件聚合反應12h。得到的乳液樣品用乙醇洗滌3次，除去未反應完全的單體和引發劑，置於真空乾燥箱(60℃、80kPa)乾燥24h。

2、微球染色

取三氯甲烷0.5ml和異丙醇4.5ml的混合溶劑、吐溫-2050mg、聚苯乙烯微球0.1g、R101(羅丹明101)8mg置於25ml燒杯中，超聲分散10min；將上述混合液在真空乾燥箱(30℃、80kPa)放置12h，當所有溶劑都揮發後，用乙醇洗滌微球、離心，重複3次除去未反應的螢光素。

3、螢光微球標記

取1mg上述製備的螢光微球加入90μl 50mg/ml對乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺(EDC)，150μl 5mg/ml氮經基唬拍酞亞胺(NHS)，振蕩混勻，室溫孵育30min後，1000×g離心15min，沉澱用0.01M的硼酸鹽緩衝液(pH4.8)溶解，並調節微球濃度為OD450為0.6。將0.1ml螢光微球中加入6μl抗精子二抗，充分混勻後，室溫攪拌反應3h，分別用超純水洗滌離心3次後，沉澱用0.01M的PBS溶液(磷酸鹽緩衝液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)復溶沉澱至起始體積後，即為螢光微球標記的抗精子二抗。

三、噴塗螢光微球標記的抗精子二抗

用噴金機將螢光微球標記的抗精子二抗按照5μl的量均勻噴塗至底卡模板的結合區，30℃真空乾燥1～2h，放於室溫乾燥環境中備用。

四、包被抗精子二抗

用0.01M PBS(磷酸鹽緩衝液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)調節抗精子二抗的濃度為0.6mg/ml，將所得的溶液按照2μl的量均勻噴塗在底卡模板的檢測區，30℃真空乾燥12h，於室溫乾燥環境中保存備用。

五、濾紙粘覆

將直徑為1.5cm的圓形濾紙粘覆在底卡模板的加樣區。

六、抗精子抗體定量檢測卡的製備

將面卡和製備好的底卡按合，壓緊，再將組裝好的檢測卡裝入鋁箔袋中，加入乾燥劑後封口保存，與室溫乾燥環境下可保存一年。

如圖1所示，該抗精子抗體定量檢測卡的底卡構造包括覆有濾紙的加樣區11、噴塗螢光微球標記的抗精子二抗的結合區12、微通道13、包被有抗精子二抗並具有特殊結構微通道的檢測區14和廢液區15。

如圖2所示，該抗精子抗體定量檢測卡的面卡構造包括加樣孔21和檢測孔22。檢測步驟如下：

1、樣品檢測：平放檢測卡，將待測血清平衡至室溫，用已滅菌的一次性滴管吸取待測血清滴一滴至加樣孔，立即將檢測卡放至螢光檢測儀中。螢光檢測儀實時檢測螢光微球在最佳激發光源的激發下所發出的螢光數值。

2、結果分析：通過螢光分析軟體分析所測螢光的變化曲線，對照其標準曲線，得出A1、A2螢光值所對應的抗精子抗體的標準濃度值AsAb2、AsAb1。

AsAb0表示待測血清中抗精子抗體的含量，AsAb1、AsAb2表示A1、A2螢光值所對應的抗精子抗體的標準濃度值，V表示在微通道中血清流體的流速，t1、t2表示A1、A2螢光值所對應的時間，根據以下公式換算出待測血清中抗精子抗體的含量：

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