一種中間蒼白桿菌scuec4菌株及其篩選方法和用途

2023-06-11 17:15:21 1

一種中間蒼白桿菌scuec4菌株及其篩選方法和用途
【專利摘要】本發明提供了一種中間蒼白桿菌SCUEC4(Ochrobactrum intermedium SCUEC4)菌株，該菌株的保藏編號為：CCTCC NO：M2014403，該菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。該菌株的不僅能夠運用於菸鹼降解中，而且還能夠加快菸葉成熟。本發明同時還提供了一種篩選分離上述菌株的方法，包括以下步驟：首先富集培養，然後分離純化最後將分離純化後的菌株按單菌落接種於菸鹼培養基中，在室溫下搖床培養1-3天後，測定菸鹼培養基的發酵液中菸鹼含量，根據菸鹼降解率的大小來復篩菌株，從而得到中間蒼白桿菌SCUEC4菌株。
CCTCC NO：M2014403
2014.09.09
【專利說明】-種中間蒼白桿菌SCUEC4菌株及其篩選方法和用途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種降解菸鹼的微生物菌株，具體涉及一種中間蒼白桿菌SCUEC4菌 株，以及該菌株的篩選方法和用途，屬於菸鹼降解【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 菸鹼不僅是存在於菸草中的最重要的化學成分，菸鹼含量的高低對菸草產品的質 量起著相當重要的作用。目前，我國烤菸菸鹼含量普遍偏高，尤其是上部菸葉更加明顯，如： 神農架周邊地區部分區域菸葉外觀質量已接近國內和國際先進水平，但一些產煙縣菸葉 菸鹼含量高達3. 5%?4. 5%，白肋煙上部菸鹼含量更是高達6%。這不但影響了上部煙的 質量，而且影響上部的可用性，給捲菸配方工業帶來了困難，制約了上部菸葉市場經營。
[0003] 迅速有效降低高菸鹼含量菸葉中的菸鹼含量是菸草行業所面臨的現實問題，因 而，國內外對降低高菸鹼含量菸葉中的菸鹼含量作了大量研究，這些研究大都集中在生態、 栽培因子、物理措施降低菸鹼含量，如施肥、過濾、打孔稀釋、菸草薄片等，而對利用生物技 術降解菸鹼研究報導較少。
[0004]中國發明專利申請（申請號為：200710013068. 3, 200710013069. 8， 200710070805. 3, 200910097536. 9,等），這些專利涉及的菌株對菸鹼具有有效的降解性能， 唯一的缺點是在室內實驗室條件下進行菸鹼降解，對於真實生產的田間菸葉是否具有作用 還未經實驗證實。


【發明內容】

[0005] 本發明提供了一種中間蒼白桿菌SCUEC4菌株，該菌株的不僅能夠運用於菸鹼降 解中，而且還能夠加快菸葉成熟。
[0006]本發明提供的中間蒼白桿菌 SCUEC4(0chrobactrum intermedium SCUEC4)菌株， 該菌株的保藏編號為：CCTCC NO :M2014403,該菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 本發明同時還提供了一種篩選分離上述菌株的方法，包括以下步驟：
[0008](1)、富集培養：將菸草種植田的土壤放入菸鹼培養基中，在室溫條件下搖床培養， 培養1-3天後，將富集液轉接至新鮮菸鹼培養基中繼續培養，重複培養轉接步驟三次以上， 以達到富集的目的，收集富集培養液備用；
[0009](2)、分離純化：採用生理鹽水按梯度逐級稀釋富集培養液，然後將稀釋液塗布在 菸鹼分離培養基中，進行培養，然後選取生長速度快、生長勢頭好的菌株進行分離純化；
[0010](3)、將分離純化後的菌株按單菌落接種於菸鹼培養基中，在室溫下搖床培養1-3 天后，測定菸鹼培養基的發酵液中菸鹼含量，根據菸鹼降解率的大小來復篩菌株，從而得到 中間蒼白桿菌 SCUEC4(0chrobactrum intermedium SCUEC4)菌株。
[0011] 所述的培養步驟具體為：在30°C條件下，採用180rpm搖床培養，培養時間為48h。
[0012] 所述的生理鹽水為質量濃度0. 9%的生理鹽水。
[0013] 本發明提供的中間蒼白桿菌SCUEC4菌株具有以下優點：1、該菌株的降解能力強， 經測試，在實驗室中該菌株的降解率最高可達到92. 68%，在田間試驗中，該菌株的菸鹼降 解率最高可達27. 34%。2、該菌株能夠加速菸葉的成熟。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為本發明實施例中菸鹼降解率曲線表。

【具體實施方式】
[0015] 下面結合具體實施例對本發明做詳細具體的說明，但是本發明的保護範圍並不局 限於以下實施例。
[0016] 本實施例中所提供的中間蒼白桿菌SCUEC4(0chrobactrum intermedium SCUEOi) 菌株於2014年9月9日保藏於中國典型培養物保藏中心，地址為：湖北省武漢市武昌區武 漢大學，保藏編號為CCTCC NO :M2014403,該菌株的16S核苷酸序列如SEQ IDN0. 1所示，包 括1160個鹼基。
[0017] 本實施例中提供的中間蒼白桿菌SCUEC4(Ochrobactrum intermedium SCUEC4)菌 株的篩選分離方法如下：（1)、富集培養：將菸草種植田的土壤2g放入菸鹼培養基20mL中， 在30°C條件下採用180rpm搖床培養，培養48h後，將lmL富集液轉接至新鮮菸鹼培養基中 繼續培養，重複培養轉接步驟三次，以達到富集的目的，收集富集培養液備用；
[0018] (2)、分離純化：採用質量濃度0.9%的生理鹽水按梯度逐級稀釋富集培養液，然 後將稀釋液塗布在菸鹼分離培養基中，進行培養，然後選取生長速度快、生長勢頭好的菌株 進行分離純化；
[0019] 在此步驟中由於菸鹼分離培養基以菸鹼作為唯一碳源，氮源為無機鹽，因此能在 此分離培養基上生長的微生物就是可能具有降解菸鹼的能力的微生物。
[0020](3)、將分離純化後的菌株按單菌落接種於菸鹼培養基中，在室溫下搖床培養1-3 天后，測定菸鹼培養基的發酵液中菸鹼含量，根據菸鹼降解率的大小來復篩菌株，從而得到 中間蒼白桿菌 SCUEC4(0chrobactrum intermedium SCUEC4)菌株。
[0021] 雖然能在以上菸鹼分離培養基上生長的菌株有可能具有降解菸鹼的能力，但還有 可能只是耐菸鹼並不降解它，所以本步驟中要對純化的菌落進行復篩。
[0022] 將本實施例中篩選得到的中間蒼白桿菌SCUEW (Ochrobactrum intermedium SCUEC4)菌株進行實驗室菸鹼降解實驗，經分析後確定最優降解條件為：菸鹼初始濃度為 2g/L、溫度為30°C、初始pH為5. 5-6. 0、以蛋白腖和牛肉膏各0. 5%作為複合氮源、微量元素 的濃度為5mL/L，在此最優條件下菸鹼降解率能達到92. 68%。實驗結果如圖1所示，在圖 1中可以看出，隨著培養時間的增長，菸鹼濃度逐漸降低，而吸光度不斷升高。
[0023] 然後進行田間菸鹼降解實驗，將本實施例中篩選得到的中間蒼白桿菌 SCUEC4(Ochrobactrum intermedium SCUEC4)菌株製成菌懸液，將菌懸液處理採收前的新 鮮菸葉，試驗完成後，經測定可有效降低菸葉中菸鹼含量，菸鹼降解率為27. 34%。同時，經 試驗發現中間蒼白桿菌SCUEC4(Ochrobactrum intermedium SCUEC4)菌株還能加速菸葉成 熟。
【權利要求】
1. 一種用於煙喊降解的中間蒼白桿菌SCUEC4(0chrobactrum intermedium SCUEC4)菌 株，該菌株的保藏編號為：CCTCC NO :M2014403,該菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -種權利要求1所述菌株的篩選分離方法，其特徵在於包括以下步驟： (1) 、富集培養：將菸草種植田的土壤放入菸鹼培養基中，在室溫條件下搖床培養，培養 1-3天後，將富集液轉接至新鮮菸鹼培養基中繼續培養，重複培養轉接步驟三次以上，以達 到富集的目的，收集富集培養液備用； (2) 、分離純化：採用生理鹽水按梯度逐級稀釋富集培養液，然後將稀釋液塗布在菸鹼 分離培養基中，進行培養，然後選取生長速度快、生長勢頭好的菌株進行分離純化； (3) 、將分離純化後的菌株按單菌落接種於菸鹼培養基中，在室溫下搖床培養1-3天 後，測定菸鹼培養基的發酵液中菸鹼含量，根據菸鹼降解率的大小來復篩菌株，從而得到中 間蒼白桿菌 SCUEC4(0chrobactrum intermedium SCUEC4)菌株。
3. 根據權利要求2所述的篩選分離方法，其特徵在於：所述的培養步驟具體為：在 30°C條件下，採用180rpm搖床培養，培養時間為48h。
4. 根據權利要求2所述的篩選分離方法，其特徵在於：所述的生理鹽水為質量濃度 0. 9%的生理鹽水。
5. 權利要求1所述的菌株在菸鹼降解中的用途。
6. 權利要求1所述的菌株在加快菸葉成熟中的用途。
【文檔編號】A62D3/02GK104328067SQ201410522701
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月30日 優先權日:2014年9月30日
【發明者】李曉華, 孔文, 郭利, 李陽, 楊振飛, 王曉麗, 何冬蘭, 程國軍, 劉濤, 李開, 曹麗君, 陳濤, 龔傳清, 李永輝, 曹祥練, 胡健康, 盧紅良, 彭功銀 申請人:中南民族大學