一種真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌及製備方法和應用的製作方法

2023-12-12 22:16:17

專利名稱：一種真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌及製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於農業微生物學技術領域，具體涉及一種真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌，同時還涉及一種真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌的製備方法，還涉及一種真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌的用途。
背景技術：
很多芽胞桿菌可以通過產生脂肽抑制真菌的生長。脂肽之所以能夠抑制真菌的生長，是由於其兩親的結構決定的，脂肽與細胞膜相互作用可以導致膜穿孔造成原生質洩露，使得菌絲體斷裂；脂肽還可以通過溶解病原菌孢子的細胞壁或細胞膜，致使細胞壁穿孔、畸形等從而抑制孢子萌發，見參考文獻(祁高富；趙秀雲；朱發銀；文凱；張世超；喻子牛。一株產促真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌及由該菌製備的脂肽與應用。專利號 CN200810197403. 4)。申請人:所在單位從水稻根部分離到一株解澱粉芽胞桿菌CH1，經過發酵可以產生脂肽類表面活性素，該脂肽對水稻紋枯病菌、玉米小斑病菌、棉花枯萎病菌、小麥赤黴病、棉花炭疽病菌、楊樹潰瘍病菌、灰黴菌等多種植物病原真菌具有顯著的拮抗效果。進一步研究發現，該脂肽對真菌的抑制作用原理不但包括使真菌菌絲發生壞死，而且包括在濃度較低時誘導真菌發生細胞凋亡，見參考文獻Oli，G.F.，Zhu, F. Y.，Du, P，et al. Lipopeptide induces apoptosis in fungal cells by a mitochondria-dependent pathway. 020P印tides，2010，31 :1978-1986 和林福呈，李德葆，枯草芽孢桿菌(Bacillus 訓計丨1化)59對植物病原真菌的溶菌作用，植物病理學報，2003，33 :174-177)。在載玻片上分別接種CHl和水稻紋枯病菌進行對峙實驗，結果發現在載玻片上受到抑制的水稻紋枯病菌出現了明顯的細胞凋亡現象，卻沒有檢測到相應的細胞壞死特徵， 推測在自然環境下芽胞桿菌類的拮抗細菌，如枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、解澱粉芽胞桿菌等，產生的脂肽濃度不足以使病原真菌壞死，通常是通過誘導真菌細胞凋亡的形式來抑制病原真菌的生長。當前，化學農藥的使用已經在全球造成了嚴重的生態破壞和環境汙染，使用高效低毒的生物農藥是農業發展的必然趨勢。本實驗中對CHl的發酵優化首先採用 Plackett-Burman設計篩選出對脂肽產量有顯著影響的因素，然後用田口設計得到了培養基各組分的最優組合。發酵液後處理採用噴霧乾燥方式進行，噴霧乾燥中，高壓氣流使發酵液形成超細液滴，使發酵液瞬時乾燥，最大限度的降低了高溫對發酵液中活性成分的傷害， 保留了抑菌活性。本研究還通過田間苗圃實驗對CHl粉末的藥效進行了檢測，並與常用的化學殺菌劑進行了比較，為脂肽類生物農藥的研究和使用提供了參考。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的缺陷，本發明的目的是在於提供了一種真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌，該菌能產生促真菌凋亡的一種脂肽，可作為抗植物病原菌的有效成分。該菌對 Rhizoctonia solani，Helminthosporium maydis，Fusarium oxysporium, Botrytis cinereapers， Gibberella zeae， Dothiorella gregaria， Colletotrichum gossypii等植物病原真菌都有明顯的抗菌效果。發酵液對油茶炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)抑制效果顯著。本發明的另一個目的是在於提供了一種真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌的製備方法，對該菌的發酵培養基、發酵條件和發酵液的後處理方法進行了摸索和優化，對發酵液進行低壓濃縮和噴霧乾燥後處理，噴霧乾燥後得到的粉末藥效存留率為86. 2%。該粉劑使用方便，可長期儲存於室溫，藥效穩定，兌水稀釋後噴霧施用，可用于田間大面積防治油茶炭疽病等真菌病害。本發明的還有一個的目的是在於提供了一種真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌在製備治療或預防油茶炭疽病藥物中的應用。苗圃實驗證明，噴霧乾燥粉末能夠很好的防治油茶炭疽病。粉劑稀釋1000倍後用于田間苗圃實驗，防治油茶炭疽病菌，解澱粉芽胞桿菌 (B. amyloliquefaciens)CHl粉劑的防效高於常用的化學農藥，防效高達74. 4% ；70%甲基託布津可溼性粉劑，防效達59. O%，50%多菌靈可溼性粉劑僅為48. %。表明該菌可有效防治油茶炭疽病菌，且與化學農藥相比，對環境無汙染，對人畜不會造成傷害。該菌可用於防治油茶炭疽病，有利於生產高品質的無公害植物油。為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施一種真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌的製備方法，其步驟是1.解澱粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的篩選分離從水稻田採集分櫱期的中花11水稻，將水稻根部外表面以自來水衝洗乾淨，再以無菌水衝洗2-4次，然後以70% (ν/ν)乙醇浸泡消毒^-3 ，以無菌水衝洗2-4次後，將水稻根部切成約Imm大小的碎塊，置於PDA培養基(含200g馬鈴薯煮出液，20g葡萄糖，20g瓊脂，加蒸餾水至1L)上於培養46-50h，獲得單菌落。2.檢測細菌的抑菌活性將分離得到的細菌以PD液體培養基(含200g馬鈴薯煮出液，20g葡萄糖，加蒸餾水至1L)於觀！，振蕩培養，發酵上清液以0. 22 μ m濾膜過濾後， 與PDA培養基按體積比混合倒平皿接種水稻紋枯病菌(華中農業大學植保系植物病理教研室)，見參考文獻(雲月利，徐冠軍.斑蝥素對植物病原菌抑制作用的研究.湖北大學學報 自然科學版，2003，25 (4) =342-345)，檢測抗菌活性。3.細菌的分類鑑定對檢測到顯著抗真菌活性的細菌進行16SrRNA和形態鑑定。用常規方法提取細菌的基因組DNA，見參考文獻(薩姆布魯克等著，金冬雁等譯.分子克隆實驗指南第二版.北京科學出版社，1999)，以16SrRNA的通用引物進行PCR。擴增產物進行序列測定後在NCBI中經Blast比較分析確定為解澱粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) 04.細菌培養和保存方法培養解澱粉芽胞桿菌的條件為PD培養基或者LB培養基，28°C -37°C培養。菌株保存方法取培養好的Bacillus, amyloliquefaciens CHl菌液添加滅菌甘油至終濃度25%於-80°C保存。申請人:通過對湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏的一株解澱粉芽胞桿菌(保藏編號為CCTCC NO :M208127)進行發酵優化和發酵放大，並對發酵液進行低壓濃縮和噴霧乾燥後處理，發現噴霧乾燥後保留了大部分抑菌活性，苗圃實驗證明，噴霧乾燥粉末能夠很好的防治油茶炭疽病。一株分離的產促真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌菌株，解澱粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciensKHl，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC :M208127，保藏單位地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2008年9月5日。解澱粉芽胞桿菌CHl (Bacillus, amyloliquefaciens CHl)的菌學特徵解澱粉芽胞桿菌CHl革蘭氏陽性，菌體杆狀，菌體大小1-1. 4 μ mX 2. 3-3. 5 μ m， 在PDA(含200g馬鈴薯煮出液，20g葡萄糖，20g瓊脂，加蒸餾水至1L)平板上能快速擴散， 不形成特定的菌落形態，邊緣不規則，呈灰白色，粘稠有莢膜，培養4 後表面有小皺褶。 在LB平板上形成米白色的菌落，菌落直徑3-5mm，表面乾燥有皺褶，中間塌陷，邊緣波狀。 37°C生長明顯快於^°C。芽胞近端生，鞭毛周生。對多種植物病原菌有顯著抑菌活性，檢測72h時的抑菌率，對油菜灰黴病菌(Botryotini fuckeliana)的抑菌率為96. 9%，對辣 ￠(^11^1 ' (Col letotrichum gloeosporioides) ^ 77. O %, MW^&SMM (Cytospora chrysosperma)為 57. O%,對甘蔴鳳梨病菌(Thielaviopsis paradoxa)為 65. 1%,對蘋果輪紋病菌(Dothiorella gregaria)為 62. O%，對小麥赤黴病菌(Fusarium graminearum) 為65. 8 %，對油菜核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)為85. 3 %，對玉米小斑病菌 (Bipolaris maydis)為 93. 4 %，對油茶炭 Iil 病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)為100%。PDB以及豆粕培養基培養的CHl培養液對植物病原菌都具有較好的抑菌效果，但2%豆粕培養基OOg豆粕粉，蒸餾水定容至1L)發酵產物的抑菌效果明顯優於PDB 培養基(馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水定容至1L)的發酵產物。解澱粉芽胞桿菌CHl可產生一種Surfactin類的環狀脂肽，命名為WHlfunginJg 肽能明顯抑制真菌細胞的葡聚糖合成酶活性，經WHlfimgin處理後，水稻紋枯病菌和假絲酵母的某些細胞能被依文思藍染色，表現出細胞膜穿孔、細胞質滲漏等現象。脂肽序列如下
權利要求
1.一株分離的產促真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌菌株，其特徵在於解澱粉芽胞杆 M (.Bacillus amyloliquefaciens ) CHl，CCTCC :M208127。
2.權利要求1所述的一種真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌的製備方法，其步驟是A、解澱粉芽胞桿菌的篩選分離從水稻田採集分櫱期的水稻，將水稻根部外表面以自來水衝洗乾淨，再以無菌水衝洗2-4次，然後以70%v/v乙醇浸泡消毒^-3 ，以無菌水衝洗 2-4次後，將水稻根部切成Imm大小的碎塊，置於PDA培養基含200g馬鈴薯煮出液，20g葡萄糖，20g瓊脂，加蒸餾水至1L，上於培養46-50h，獲得單菌落；B、檢測細菌的抑菌活性將分離得到的細菌以PD液體培養基含200g馬鈴薯煮出液， 20g葡萄糖，加蒸餾水至仏，於觀！，振蕩培養，發酵上清液以0.22 μ m濾膜過濾後，與 PDA培養基按體積比混合倒平皿接種水稻紋枯病菌，檢測抗菌活性；C、細菌的分類鑑定對檢測到顯著抗真菌活性的細菌進行16SrRNA和形態鑑定；用常規方法提取細菌的基因組DNA，以16SrRNA的通用引物進行PCR，擴增產物進行序列測定後在NCBI中經Blast比較分析確定為解澱粉芽胞桿菌；D、細菌培養和保存方法培養解澱粉芽胞桿菌的條件為PD培養基或者LB培養基， 280C _37°C培養，菌株保存取培養好的feciB^s. amyloliquefaciens CHl菌液添加滅菌甘油至終濃度25%於-80°C保存。
3.權利要求1所述的一種真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌在製備治療或預防油茶炭疽病藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌及製備方法和應用，其步驟A、解澱粉芽胞桿菌的篩選分離採集分櫱期的水稻，將水稻根部衝洗，以乙醇浸泡消毒，將水稻根部切塊，置於培養基上培養，獲得單菌落；B、檢測細菌的抑菌活性將分離得到的細菌以PD液體培養，檢測抗菌活性；C、細菌的分類鑑定對檢測到顯著抗真菌活性的細菌進行形態鑑定；D、細菌培養和保存培養解澱粉芽胞桿菌的條件為PD培養基，菌株於低溫保存。該菌在製備治療或預防油茶炭疽病藥物中的應用方法易行，操作簡便，脂肽以其抗菌譜廣、抗菌作用強、穩定性好，防治效果穩定，其產生的抗菌物質-脂肽活性穩定，抗高溫、抗蛋白酶解，是一種高效穩定的抗菌物質。
文檔編號A01P3/00GK102268390SQ20111018978
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月7日 優先權日2011年7月7日
發明者信姍姍, 李菁菁, 王聖英, 祁高富, 趙秀雲 申請人:華中農業大學