一種纖維伸長期優勢表達的啟動子及製備方法和應用的製作方法

2023-12-11 22:42:07 6

一種纖維伸長期優勢表達的啟動子及製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種纖維伸長期優勢表達的啟動子及製備方法和應用，該啟動子主要在伸長期優勢表達，將這兩個啟動子PGhGLP2和PGbGLP3與GUS融合轉化棉花，組織化學染色表明：啟動子PGhGLP2和PGbGLP3都是除了在開花當天的胚珠上沒有表達外，從1DPA開始都能在纖維上檢測到GUS的表達，但在胚珠中是沒有表達的。但這兩個啟動子的表達高峰是在棉花纖維伸長期。伸長期對於棉花纖維來說是一個非常關鍵的時期，在遺傳改良中運用該啟動子特異的表達某些對纖維高品質的形成非常關鍵的基因將會增加棉花的產量而不影響其他組織器官的生長。
【專利說明】一種纖維伸長期優勢表達的啟動子及製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物基因工程【技術領域】。更具體涉及一種棉花纖維發育時期特異啟動子，及一種纖維伸長期優勢表達的啟動子的用途。通過克隆、鑑定兩個棉花纖維伸長期特異性啟動子，將其應用於棉花纖維品質改良的遺傳轉化。
【背景技術】
[0002]棉花纖維是一種重要的紡織業原料，對棉花纖維的遺傳改良有利於棉紡工業的發展，棉花纖維細胞從開花當天開始，經歷起始，延長，次生壁沉積及成熟四個階段，最後發育成一個長達3釐米左右、次生壁中纖維素含量達百分之九十多的纖維細胞。為此，對棉花纖維細胞的研究是改良纖維品質的重要手段。
[0003]真核生物基因的表達受到轉錄前、轉錄水平、轉錄後加工、轉運、翻譯水平以及蛋白活性的調控，其中轉錄水平的調控是基因表達中最基本的環節，啟動子是基因表達所必需的，決定了外源基因表達的空間、時間和表達的強度，是人們利用基因工程和轉基因技術定向植物的重要限制因素。
[0004]目前一批棉花組織特異啟動子已經得到表達特性分析(John和Crow, Geneexpression in cotton(Gossypium hirsutum L.)fiber:Cloning of the mRNAs, ProcNatl Acad Sci U S A, 89:5769-73 1992 ；Rinehart 等，Control of plant trichomedevelopment by a cotton f iber Myb gene, Plant Cell,16:2323-2334，2004 ;Zhang等，Members of a new group of chitinase—like genes are expressed preferentiallyin cotton cells with secondary walls, Plant Mol Biol,54:353-72, 2004 ；Li 等，The cotton actinl gene is functionally expressed in f ibers and participatesin fiber elongation,Plant Cell, 17:859-875, 2005 ；ffu 等，Isolation of a cottonreversibly glycosylated polypeptide (Ghrgpl) promoter and its expression activity in transgenic tobacco, J Plant Physiol, 163:426-35，2006)。這些啟動子中 E6 表達高峰在纖維發育10天左右，FbL2A啟動子在開花後20天纖維中特異表達，表達高峰在纖維發育的第35DPA。由於棉花纖維特異啟動子在棉花基因工程改良中的潛在應用價值，使幾乎所有的棉花纖維特異啟動子都申請了專利。目前利用已有纖維特異啟動子對棉花纖維發育相關基因進行功能驗證的相關研究還比較少。
[0005]傳統的育種方法對棉花產量潛力的挖掘和纖維品質的提高在近年來進展不大，現有的棉花種質資源已使棉花的產量和品質達到某種平臺。生物技術的快速發展及其在農業上的應用為作物育種和生產提供了新途徑，形成農業發展的第二次綠色革命。轉基因育種及基因功能驗證除了對目標基因有要求，啟動子也是一個不可忽視的方面。目前，棉花的基因工程中普遍使用是組成型CaMV35s啟動子。在棉花的抗蟲基因工程中逐漸暴露了組成型啟動子的諸多缺點。因此分離鑑定棉花纖維特異高效表達啟動子無論在棉花基礎研究還是在分子育種研究中都有重要的應用價值。
【發明內容】

[0006]本發明的目的是在於提供了一種棉花纖維伸長期優勢表達啟動子，該啟動子主要在伸長期優勢表達，伸長期對於棉花纖維來說是一個非常關鍵的時期，在遺傳改良中運用該啟動子特異的表達某些對纖維高品質的形成非常關鍵的基因將會增加棉花的產量而不影響其他組織器官的生長。
[0007]本發明的再一個目的是在於提供了一種棉花纖維伸長期優勢表達啟動子在棉花纖維品質改良的遺傳轉化中的應用，利用該啟動子轉化棉花。現有的常用於轉基因的是組成型CaMV35s啟動子，它能夠驅動基因在整個生育期及各個組織表達，在棉花的抗蟲基因工程中逐漸暴露了組成型啟動子的諸多缺點。該啟動子在纖維中高效優勢表達，因此棉花纖維特異高效表達啟動子無論在棉花基礎研究還是在分子育種研究中都有重要的應用價值。
[0008]為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施:
[0009]一種棉花纖維伸長期優勢表達啟動子的製備方法，其步驟是:
[0010]A、本研究是在研究海島棉纖維發育相關基因表達譜的基礎上發掘的一個在陸地棉纖維伸長期高豐度表達的基因GhGLP2及在海島棉(請見填寫遺傳資源表)伸長期高豐度表達的基因GbGLP3。
[0011]B、進而進行該基因伸長期優勢表達的驗證(圖2)，圖2A為一種GhGLP2的RT-PCR的結果示意圖。以看出在纖維的不同發育時期都有表達，表達的高峰時在5-15DPA。但在根和葉中是沒有的表達的。圖2B是GbGLP3的RT-PCR的結果，在0-20DPA的纖維中不同發育時期的表達高峰時在10DPA和1OTPA。
[0012]C、用Genomewalking克隆基因的啟動子序列(圖1)。根據試劑盒對PCR引物的要求設計基因特異引物。擴增基因GhGLP2和GbGLP3的啟動子。在凝膠電泳後用凝膠回收試劑盒回收目的片段(Qiagene, Germany Cat.N0.28704)後進行TA克隆,測序。一種分離的啟動子，PGhGLP2啟動子長度為1332bp，其序列為SEQ ID NO:1所示的DNA分子。一種分離的啟動子，PGbGLP3啟動子長度為641bp其序列為SEQ ID NO:2所示的核甘酸序列。
[0013]本發明提供的棉花纖維伸長期優勢表達的兩個啟動子名稱分別命名為PGhGLP2和PGbGLP3，其序列為SEQ ID NO:1所示的核甘酸序列和序列為SEQ ID NO:2所示的核甘酸序列。
[0014]本發明製備的啟動子PGhGLP2和PGbGLP3，擴增所述PGhGLP2和PGbGLP3全長及其任一片段的引物對也屬於本發明的保護範圍。
[0015]所述重組表達載體具體可為如圖4所示的表達載體或將其他元件替換但包含PGhGLP2和PGbGLP3啟動子的表達載體。
[0016]一種棉花纖維伸長期優勢表達啟動子在棉花纖維品質改良的遺傳轉化中的應用，其步驟是:
[0017]1、無菌苗的培養
[0018]將棉籽殼(品種名稱)去掉，用0.1/100的升汞滅菌十分鐘，無菌水衝洗三遍，接種於無菌苗培養基上(配方如下:2/lMS大量元素+葡萄糖15g.L-1+植物膠phytagel 2.5g.171)，在28°C，暗培養3-6天。
[0019]2.農桿菌的活化和保存[0020]2.1 準備:
[0021]農桿菌LBA4404 (請見填寫遺傳資源表)，製備含卡那黴素50mg.L—1的MGL液體培養基(配方:胰化蛋白腖 5g/L，氯化鈉 5g.1AMgSO4.7H20 0.lg.L-1，KH2PO40.25g.L-1，甘露醇5g.L—1，甘氨酸1.0g.L—1，調pH至7.0)，無菌三角瓶，LB (固、液)培養基(含卡那黴素50mg.L—1),滅菌甘油,無菌槍頭,無菌1.5mL離心管。
[0022]2.2 操作:
[0023]2.2.1 活化，懸浮:
[0024]從超低溫冰箱內取出保存菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿上劃線，26.5°C暗培養36-48hr，待皿內長出清晰的單菌落，挑取單菌落在另外的LB平皿劃線，26.5 °C暗培養36-48hr，待皿內長出足夠的菌落結束培養，把培養基表面菌落刮入三角瓶內的MGL培養基中，28°C、200rpm搖2hr，OD值在0.5-1.5之間即可用於侵染。
[0025]2.2.2菌株(EHA4404 (請見填寫遺傳資源表))的保存:
[0026]從培養皿內挑取單菌落接於LB液體培養基中150rpm，26°C搖48hr，按菌液和甘油體積比為1:1加入1.5mL離心管混勻，-70°C保存。
[0027]3.浸染，共培養:
[0028]3.1 準備:
[0029]暗培養5天左右幼嫩健壯的YZ-1幼苗，經活化的農桿菌(EHA4404 (請見填寫遺傳資源表))，無菌培養皿和無菌濾紙等。
[0030]3.2 操作:
[0031]無菌條件下將YZ-1幼苗下胚軸用鋒利的刀片切成0.5-lcm長的切段，轉入到經活化的農桿菌菌液中，攪勻，靜置5-10分鐘，倒掉菌液，濾紙吸乾殘餘菌液，吹5分鐘使表面稍為乾燥，薄層分散布於墊有濾紙的共培養培養基中(配方:調pH至7.0)，於19-21°C暗培養38-42小時。
[0032]4.愈傷組織的誘導
[0033]將侵染共培養後的下胚軸切段接種於誘導培養基上(配方如下:MS無機鹽+B5有機物 +2, 4-D 0.lmg.L ^KT0.lmg.L 1 葡萄糖 30g.L 1+phytagel 2.5g.L \ 調 pH 至 7.0,調 pH至 7.0)。
[0034]5、非胚性愈傷組織的增殖
[0035]非胚性愈傷組織的增殖培養基如下所示:MS無機鹽(硝酸鉀加倍，硝酸銨減半)+B5 有機物 +2, 4-D 0.05mg.L ^KT0.lmg.L 丨+葡萄糖 30g.L 1+phytagel 2.5g.L S 調 pH至 7.0。
[0036]6、愈傷組織的分化
[0037]愈傷組織經繼代(一個月繼代一次)幾次後，有的愈傷組織轉化成米粒狀顆粒，將其轉入分化培養基上(配方=MS基本培養基+B5有機物+激動素(KT)0.15mg.L—1+吲哚丁酸(IBA)0.5mg.171+ 葡萄糖 30g.171+phytagel 2.5g.L-1,調 pH 至 7.0),進一步分化成胚狀體。
[0038]7、胚性愈傷組織的繼代
[0039]胚性愈傷組織的繼代培養基如下所示:
[0040]MS無機鹽(其中硝酸鉀加倍，硝酸銨減半)+B5有機物+KT 0.15mg.1^+IBA0.5mg.L-1+Gln (谷胺醯胺)1.0mg.171+ 天冬醯胺(As n) 0.5mg.171+ 葡萄糖 30g.L_1+phytagel 2.5g.L-1調 pH 至 7.0。
[0041]8、成苗生根培養
[0042]將分化出的小苗繼代到1/2MS培養基中成苗生長培養基上(配方:1/2MS無機鹽+B5 有機物 + 葡萄糖 15g.L—1+phytagel 2.5g.L_S 調 pH 至 7.0)。
[0043]9、煉苗移栽
[0044]將生根良好的小苗揭開三角瓶封口膜，煉苗2-3天，然後移栽到小土缽中，遮蔭緩苗一周左右移栽大田。
[0045]附:MS培養基母液配製:
[0046]1.配製大量元素時各種藥品分別稱量，分別充分溶解，逐一加到容量瓶中，一定要最後加入CaC12否則容易產生沉澱，定容到一升。
[0047]2.配製微量元素時幾種極微量藥品先可以配成一級母液(濃縮10000倍)，再稀釋成二級母液(濃縮100倍)，母液配製完畢後放置於室溫下10小時以上，看是否有沉澱產生，然後才能使用。
[0048]3.配製鐵鹽時，兩種鹽用熱水分別溶解，然後混合，放置於室溫下10小時以上看是否有沉澱產生，然後才能使用。
[0049]4.各種生長激素一般可以用I摩爾/升的NaOH或HCl溶解後，再定容。
[0050]5.配製B5有機物時要用無菌水來配製，一次不要配太大體積，及時用完以防汙染
[0051]6.各種母液配製好後應存放在4°C冰箱中，發現有沉澱後，不得使用。
[0052]大量元素(20倍)母液(g/L)
【權利要求】
1.一種分離的啟動子，其序列為SEQ ID NO:1所示的核甘酸序列。
2.一種分離的啟動子，其序列為SEQ ID NO:2所示的核甘酸序列。
3.權利要求1或2所述的一種分 離的啟動子在棉花纖維品質改良的遺傳轉化中的應用。
【文檔編號】C12N15/113GK103589720SQ201210288775
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月14日 優先權日:2012年8月14日
【發明者】塗禮莉, 胡海燕, 譚家福, 張獻龍 申請人:華中農業大學