源於草酸青黴的黑麥酮酸I在製備抗人結腸癌藥物的應用的製作方法
2023-07-31 00:55:56
本發明涉及源於草酸青黴的黑麥酮酸i在製備抗人結腸癌藥物的應用，屬於醫藥領域。
背景技術：
黑麥酮酸類化合物（secalonicacids）屬於麥角色素類（ergochrome）次生代謝產物，為氧雜蒽酮二聚物。自從stoll等在1952年從真菌中分離得到黑麥酮酸a（secalonicacida）之後，該系列的化合物黑麥酮酸（a,b,c,d,e,f,g）就不斷地被發現及研究。黑麥酮酸類化合物具有各種不同的生理活性，以黑麥酮酸d（secalonicacidd,sad）為例，5mg/ml的sad加入到生理鹽水中,在5-20mg範圍內，即可以治療早期膀胱癌，50-100mg範圍內，對更嚴重的膀胱癌有療效並且沒有副作用發生。經研究發現，一些海洋真菌能夠在次級代謝過程中產生結構新穎、活性好的黑麥酮酸類化合物，具有很好的藥用和產業化前景。
本發明人研究得知，草酸青黴(penicilliumoxalicum)ibpt-6，(已於2013年12月25日保藏在中國典型培養物保藏中心，地址:武漢武漢大學，保藏編號是：cctccno：m2013714)的發酵產物的粗提取物有很好的細胞增殖抑制活性，遂對其活性成分進行研究。研究發現所示黑麥酮酸類化合物具有抗人結腸癌活性，目前尚未見該化合物對人結腸癌細胞的增殖抑制活性的報導，因此市場上也尚未見有與此相關的藥物。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種源於草酸青黴的黑麥酮酸類化合物secalonicacidi製備方法及其抑制人結腸癌細胞增殖方面的應用。該化合物具有抑制結腸癌細胞增殖作用，具有抗人結腸癌活性。其結構式為：
。
該化合物的製備方法，是通過發酵培養草酸青黴(penicilliumoxalicum)ibpt-6，獲取發酵物，然後從發酵物中分離純化出該化合物。具體步驟如下：
1發酵生產
培養微生物的常規方法，取草酸青黴(penicilliumoxalicum)ibpt-6接種到pda固體斜面培養基上在28℃培養箱中培養2至3天，然後接種到培養液中，28℃靜止培養30天後，獲得菌絲體和發酵液；所述培養液組成：每升水含甘露醇20.0g、酵母膏3.0g、麥芽糖20.0g、味精10.0g、葡萄糖10.0g、kh2po40.5g、mgso4·7h2o0.3g、nacl15.0g；
2浸膏的獲得
用紗布將菌絲體和發酵液分離。菌絲體用丙酮溶液（含20%~30%水）連續超聲破壁3次，過濾去除殘渣，得到菌絲體的含丙酮和水的粗提物。減壓濃縮去除丙酮，得到粗體物的水溶液，再以體積比1:2加入乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯粗提液，減壓濃縮至近幹得菌絲體浸膏36.5g。
3化合物的分離精製
菌絲體浸膏通過100-200目矽膠拌樣，以石油醚：二氯甲烷：甲醇為梯度洗脫液，進行減壓矽膠色譜柱層析。經過簡單的薄層色譜分析，合併，分離成組分a-e。組分d(5.9g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:1的洗脫物)以二氯甲烷：甲醇為梯度洗脫劑，進行加壓柱矽膠色譜層析，經過薄層色譜分析後合併得到五個亞組分d1-d5。組分d2(1.2g)以三氯甲烷：甲醇=1:2為梯度洗脫劑，進行凝膠柱層析（sephadexlh-20），經過薄層色譜分析後合併得到四個亞組分d2-1~d2-4。d2的亞組分d2-3(212mg)通過半製備液相色譜(1010型ods-a，10×250mm，5μm)：分離流速為5ml/min，流動相為55%乙腈含0.1%tfa，得到所示化合物(2.7mg，tr13.8min)。
所述草酸青黴(penicilliumoxalicum)ibpt-6，已於2013年12月25日保藏在中國典型培養物保藏中心，地址:武漢武漢大學，保藏編號是：cctccno：m2013714。
本發明還保護了所述的化合物在製備抑制人結腸癌細胞增殖藥物中的應用，及該化合物在製備抗人結腸癌藥物中的應用。
本發明的顯著優點：研究所示該黑麥酮酸化合物未見報導且具有顯著的抑制人結腸癌細胞增殖活性，目前尚未見該化合物對人結腸癌細胞增殖抑制活性的報導，因此市場上也尚未見有與此相關的藥物。
附圖說明
圖1secalonicacidi主要的cosy，hmbc和noe信號。
具體實施方式
在如下的實施例中所指的化合物的化學結構：
實施例1該化合物的發酵生產及分離精製
1發酵生產
生產菌的發酵培養：按培養微生物的常規方法，取草酸青黴(penicilliumoxalicum)ibpt-6(已於2013年12月25日保藏在中國典型培養物保藏中心，地址:武漢武漢大學，保藏編號是：cctccno：m2013714)適量，接種到pda固體斜面培養基上在28℃培養箱中培養2至3天。
取斜面培養2至3天的草酸青黴(penicilliumoxalicum)ibpt-6適量，接種到裝有400ml培養液[培養液組成(克/升)：甘露醇20.0，酵母膏3.0，麥芽糖20.0，味精10.0，葡萄糖10.0，kh2po40.5，mgso40.3，nacl15.0定容]的1000ml錐形瓶中，28℃靜止培養30天後，獲得菌絲體和發酵液。
2浸膏的獲得
用紗布將菌絲體和發酵液分離。菌絲體用丙酮溶液（含20%~30%水）連續超聲破壁3次，過濾去除殘渣，得到菌絲體的含丙酮和水的粗提物。減壓濃縮去除丙酮，得到粗體物的水溶液，再以體積比1:2加入乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯粗提液，減壓濃縮至近幹得菌絲體浸膏36.5g。
3化合物的分離精製
菌絲體浸膏通過200目矽膠拌樣，以石油醚：二氯甲烷：甲醇為梯度洗脫液，進行減壓矽膠色譜柱層析。經過簡單的薄層色譜分析，合併，分離成組分a-e。組分d(5.9g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:1的洗脫物)以二氯甲烷：甲醇為梯度洗脫劑，進行加壓柱矽膠色譜層析，經過薄層色譜分析後合併得到五個亞組分d1-d5。組分d2(1.2g)以三氯甲烷：甲醇=1:2為梯度洗脫劑，進行凝膠柱層析（sephadexlh-20），經過薄層色譜分析後合併得到四個亞組分d2-1~d2-4。d2的亞組分d2-3(212mg)通過半製備液相色譜(1010型ods-a，10×250mm，5μm)：分離流速為5ml/min，流動相為55%乙腈含0.1%tfa，得到所示化合物(2.7mg，tr13.8min)。
化合物常溫下為黃色油狀物，高分辨電噴霧質譜hresi-ms在m/z：659.1377處給出分子離子峰[m+na]+（calcdforc32h28nao14，659.1377），提示分子量為636，結合波譜信息推測分子式為c32h28o14。1h和13c-nmr數據見表1，主要的cosy，hmbc和noe信號見圖1。
表1化合物的1h和13c-nmr數據(500mhz1hand126mhz13c，indmsod6)
實施例2體外抗腫瘤活性的測試
1實驗樣品及實驗方法
被測樣品溶液的配製測試樣品為上述實施1中分離精製的化合物純品。精密稱取適量樣品，用甲醇配製成所需濃度的溶液，供測活性。
細胞系及細胞的繼代培養採用腫瘤細胞系，腫瘤細胞用含10%fbs的dmem培養基，在37℃於通入5%co2的培養箱中繼代培養。
細胞增殖抑制活性測試方法
四氮唑鹽（mtt）法取對數生長期的腫瘤細胞，將細胞密度調至每毫升2×105個細胞，按每孔200微升接種於96孔細胞培養板中，於37℃通入5%co2的培養箱中培養4小時。每孔加入2微升的樣品液或空白溶液，培養24小時之後，每孔加入mtt液（mtt的每毫升5毫克生理鹽水溶液）10微升，繼續培養4小時，37℃、2000轉/分鐘離心8分鐘，吸取上清。每孔加入dmso各100微升，在微量振蕩器上振蕩15分鐘，至結晶完全溶解之後，利用md公司生產的spectramaxplus型酶標儀測定每孔在570nm處的吸光（od）值。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設置三孔，另設置三孔的空白對照和無細胞凋零孔（如果藥物有顏色要做相應藥物濃度無細胞凋零）。各孔od值先做相應無細胞凋零，再取三孔平均od值按ir(%)=(od空白對照-od樣品)/od空白對照×100%計算每個濃度下細胞的增殖抑制率（ir%）。
2.實驗結果
細胞增殖抑制活性測試結果
在mtt法測試中，根據不同濃度的該化合物的腫瘤細胞增殖抑制率，應用spss16.0軟體進行數據處理並計算半數抑制濃度ic50值。結果見表2。
表2化合物對人結腸癌細胞增殖的抑制活性
3.結論
該化合物對人結腸癌細胞具有較好的抗腫瘤活性。可作為製備結腸癌細胞增殖抑制藥物或抗腫瘤藥物用於結腸癌的研究。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。