一種硫酸多粘菌素e組分純化方法
2023-07-31 02:19:01
一種硫酸多粘菌素e組分純化方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及醫藥技術領域，具體地涉及硫酸多粘菌素E組分純化方法。
【背景技術】
[0002]多粘菌素E是一個由多種組份組成的多肽類抗生素，主要由E2和El組成。在20世紀50年代，多粘菌素E就應用於臨床，主要用於革蘭氏陰性菌引起的感染，特別是由多重耐藥綠膿桿菌、鮑氏不動桿菌等引起感染的治療。
[0003]自上世紀80年代開始因高發的腎臟毒性和神經毒性，多粘菌素E的應用受到限制，並幾乎被臨床棄用。但是近年來，由於革蘭氏陰性菌耐藥株尤其是多耐藥菌株感染病例的出現以及新藥開發有限的情況下多粘菌素E再次引起了全球醫療界的重視。同樣如何提高多粘菌素E的抗菌活性、降低其毒性從而擴大臨床適用人群也成為了藥學研究者所面臨的技術難點。
[0004]眾所周知多組份藥物製劑的穩定性較難控制，特別是對於注射劑而言多組分藥物的理化穩定性、滲透壓、澄明度、酸鹼度等方面因易受組分間相互作用，不容易形成穩定的藥物製劑，並且由於儲存、溫度、光照等因素多組份藥物製劑更容易出現變色、沉澱、分解等變化。此外，多組分藥物的有效性和潛在的安全性也存在一定的缺陷。另外，多組份藥物由於組份間的化學結構差異會導致它們在體內的藥代動力學行為的差異，增加了藥代動力學研究的難度，從而對設計安全的藥物劑量以及合理的給藥方式帶來技術障礙。因此，發明一種純化多粘菌素E的方法，獲得El和E2組分純化物是非常必要的。
[0005]凝膠技術是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被分離物質的分子大小不同來進行分離。凝膠介質是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質，小分子物質能進入其內部，流下時路程較長，而大分子物質卻被排除在外部，下來的路程短，當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題是提供一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，旨在根據多粘菌素E2和El分子量的不同，利用凝膠技術得到硫酸多粘菌素E2組分和El組分純化物，純化含量大於等於80%，甚至可以大於等於90%。
[0007]為解決上述技術問題，本發明所採取的技術方案是:一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特徵在於:包括以下步驟:
[0008](a)將硫酸多粘菌素E用水溶解，上樣於凝膠介質；
[0009](b)待步驟(a)完成後用有機溶劑洗脫，分段收集、合併含硫酸多粘菌素E2和El的洗脫液；
[0010](c)取步驟(b)中合併後的洗脫液，去除有機溶劑後用硫酸調節pH值；
[0011](d)待步驟(C)完成後噴霧乾燥，即得硫酸多粘菌素E2組分和El組分的純化物。
[0012]進一步的技術方案在於，所述凝膠介質採用葡聚糖凝膠，型號為G-10、G-15、G-25中的一種或多種。
[0013]進一步的技術方案在於，所述凝膠介質的載樣量為30g/L-60g/L。
[00Μ]進一步的技術方案在於，所述凝膠介質的載樣量為優選為30g/L_40g/L。
[0015]進一步的技術方案在於，所述有機溶劑為甲醇、氯仿或乙腈，其濃度為20-45%。
[0016]進一步的技術方案在於，所述有機溶劑為甲醇溶液，其濃度為30-40%。
[0017]進一步的技術方案在於，所述步驟(b)的具體步驟為:待步驟(a)完成後用配置好的有機溶劑，以0.8?1.2BV/h的流速進行洗脫，當用0.25 %的磷鎢酸滴定有白色沉澱時開始收集，每I小時的出樣收集為一組出樣小組，直至用0.25%的磷鎢酸滴定無白色沉澱;每組出樣小組均進行液相檢測，將含硫酸多粘菌素E2的組分含量以及含硫酸多粘菌素El的組分含量均大於85 %的出樣小組進行合併。
[0018]進一步的技術方案在於，所述步驟(C)具體步驟為:取步驟(b)中合併後的洗脫液，採用真空薄膜蒸發法去除有機溶劑，其溫度為40-60 V ；然後用硫酸溶液調節pH值為3.4-4.4。
[0019]進一步的技術方案還在於，步驟(d)中噴霧乾燥進風溫度130-190°C，出風溫度90-1lOcC0
[0020]採用上述技術方案所產生的有益效果在於:本發明中利用凝膠進行操作，由於其屬於惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，對多粘菌素E2和El組分不造成任何破壞，所以最大程度的保護了多粘菌素E2和El組分，其純化物含量可達90%。
【附圖說明】
[0021]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明。
[0022]圖1是本發明實施例中的硫酸多粘菌素E2分析結果；
[0023]圖2是本發明實施例中的硫酸多粘菌素El分析結果。
【具體實施方式】
[0024]下面結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
[0025]在下面的描述中闡述了很多具體細節以便於充分理解本發明，但是本發明還可以採用其他不同於在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似推廣，因此本發明不受下面公開的具體實施例的限制。
[0026]本發明包括以下步驟:
[0027](a)將硫酸多粘菌素E用水溶解，上樣於凝膠介質；
[0028](b)待步驟(a)完成後用有機溶劑洗脫，分段收集、合併含硫酸多粘菌素E2和El的洗脫液；
[0029](c)取步驟(b)中合併後的洗脫液，去除有機溶劑後用硫酸調節pH值；
[0030](d)待步驟(C)完成後噴霧乾燥，即得硫酸多粘菌素E2組分和El組分的純化物。
[0031]優選的，所述凝膠介質採用葡聚糖凝膠，型號為G-10、G-15、G-25中的一種或多種。
[0032]優選的，所述凝膠介質的載樣量為30g/L-60g/L。
[0033]優選的，所述凝膠介質的載樣量為優選為30g/L-40g/L。
[0034]優選的，所述有機溶劑為甲醇、氯仿或乙腈，其濃度為20-45%。
[0035]優選的，所述有機溶劑為甲醇溶液，其濃度為30-40%。
[0036]優選的，所述步驟(b)的具體步驟為:待步驟(a)完成後用配置好的有機溶劑，以
0.8?1.2BV/h的流速進行洗脫，當用0.25 %的磷鎢酸滴定有白色沉澱時開始收集，每I小時的出樣收集為一組出樣小組，直至用0.25%的磷鎢酸滴定無白色沉澱;每組出樣小組均進行液相檢測，將含硫酸多粘菌素E2的組分含量以及含硫酸多粘菌素El的組分含量均大於85%的出樣小組進行合併。
[0037]優選的，所述步驟(c)具體步驟為:取步驟(b)中合併後的洗脫液，採用真空薄膜蒸發法去除有機溶劑，其溫度為40-60°C ;然後用硫酸溶液調節pH值為3.4-4.4。
[0038]優選的，步驟(d)中噴霧乾燥進風溫度130_190°C，出風溫度90_110°C。
[0039]實施例1.
[0040](a)稱取適量硫酸多粘菌素E，加水溶解成100g/L濃度的溶液，按照30g/L的載樣量上樣於G-1O凝膠介質；
[0041 ] (b)用35 %甲醇溶液對其進行洗脫，流速0.8BV/h，當用0.25 %的磷鎢酸滴定有白色沉澱時開始收集，定時每30min收集一組出樣小組，分別用分析型HPLC分析、色譜條件參見歐洲藥典8.0中關於多粘菌素E的純度測定，將硫酸多粘菌素E2純度在90%以上且硫酸多粘菌素El純度在90%以上的洗脫液進行合併；
[0042](c)將上步驟中合併的洗脫液用真空薄膜蒸發去除有機溶劑，溫度50°C，再用硫酸調節pH值4.0;
[0043 ] (d)噴霧乾燥，進風溫度190 °C，出風溫度110 °C。結果得到15g硫酸多粘菌素E2和Sg硫酸多粘菌素El，它們的HPLC分析圖見圖1和圖2，含量均在90%以上。
[0044]實施例2.
[0045](a)稱取適量硫酸多粘菌素E，加水溶解成100g/L濃度的溶液，按照60g/L的載樣量上樣於G-25凝膠介質；
[0046](b)用20 %氯仿溶液洗脫，流速0.8BV/h，定時每30min收集一組出樣小組，分別用分析型HPLC分析、色譜條件參見歐洲藥典8.0中關於多粘菌素E的純度測定，將硫酸多粘菌素E2純度在90%以上且硫酸多粘菌素El純度在90%以上的洗脫液進行合併；
[0047](c)將上步驟中合併的洗脫液用真空薄膜蒸發去除有機溶劑，溫度40°C，再用硫酸調節PH值4.2;
[0048](d)噴霧乾燥，進風溫度130°C，出風溫度90°C。結果得到12g硫酸多粘菌素E2和5g硫酸多粘菌素El，含量均在90%以上。
[0049]實施例3.
[0050](a)稱取適量硫酸多粘菌素E，加水溶解成100g/L濃度的溶液，按照40g/L的載樣量上樣於G-15凝膠介質；
[0051 ] (b)用45 %乙腈溶液洗脫，流速0.8BV/h，定時每30min收集一組出樣小組，分別用分析型HPLC分析、色譜條件參見歐洲藥典8.0中關於多粘菌素E的純度測定，將硫酸多粘菌素E2純度在90%以上且硫酸多粘菌素El純度在90%以上的洗脫液進行合併；
[0052](c)將上步驟中合併的洗脫液用真空薄膜蒸發去除有機溶劑，溫度60°C，再用硫酸調節pH值3.8;
[0053](d)噴霧乾燥，進風溫度180°C，出風溫度90°C。結果得到18g硫酸多粘菌素E2和1g硫酸多粘菌素El，含量均在90%以上。
[0054]實施例4.
[0055](a)稱取適量硫酸多粘菌素E，加水溶解成100g/L濃度的溶液，按照35g/L的載樣量上樣於G-1O和G-25混合凝膠介質；
[0056](b)用35 %甲醇溶液洗脫，流速0.8BV/h，定時每30min收集一組出樣小組，分別用分析型HPLC分析、色譜條件參見歐洲藥典8.0中關於多粘菌素E的純度測定，將硫酸多粘菌素E2純度在90%以上且硫酸多粘菌素El純度在90%以上的洗脫液進行合併；
[0057](c)將上步驟中合併的洗脫液用真空薄膜蒸發去除有機溶劑，溫度50°C，再用硫酸調節PH值4.2;
[0058](d)噴霧乾燥，進風溫度180°C，出風溫度90°C。結果得到20g硫酸多粘菌素E2和9g硫酸多粘菌素El，含量均在90%以上。
[0059]本發明中純化物含量大於等於80%，甚至大於等於90%。本發明中凝膠技術工藝，操作條件比較溫和，對多粘菌素E2和El組分不造成任何破壞。
【主權項】
1.一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特徵在於:包括以下步驟: (a)將硫酸多粘菌素E用水溶解，上樣於凝膠介質； (b)待步驟(a)完成後用有機溶劑洗脫，分段收集、合併含硫酸多粘菌素E2和El的洗脫液； (c)取步驟(b)中合併後的洗脫液，去除有機溶劑後用硫酸調節pH值； (d)待步驟(c)完成後噴霧乾燥，即得硫酸多粘菌素E2組分和El組分的純化物。2.根據權利要求1所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特徵在於:所述凝膠介質採用葡聚糖凝膠，型號為G-10、G-15、G-25中的一種或多種。3.根據權利要求1所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特徵在於:所述凝膠介質的載樣量為30g/L-60g/L。4.根據權利要求3所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特徵在於:所述凝膠介質的載樣量為優選為30g/L-40g/L。5.根據權利要求1所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特徵在於:所述有機溶劑為甲醇、氯仿或乙腈，其濃度為20-45%。6.根據權利要求5所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特徵在於:所述有機溶劑為甲醇溶液，其濃度為30-40%。7.根據權利要求1所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特徵在於:所述步驟(b)的具體步驟為:待步驟(a)完成後用配置好的有機溶劑，以0.8?1.2BV/h的流速進行洗脫，當用0.25%的磷鎢酸滴定有白色沉澱時開始收集，定時收集一組出樣小組，直至用0.25%的磷鎢酸滴定無白色沉澱;每組出樣小組均進行液相檢測，將含硫酸多粘菌素E2的組分含量以及含硫酸多粘菌素El的組分含量均大於85%的出樣小組進行合併。8.根據權利要求1所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特徵在於:所述步驟(c)具體步驟為:取步驟(b)中合併後的洗脫液，採用真空薄膜蒸發法去除有機溶劑，其溫度為40-60 0C ；然後用硫酸溶液調節pH值為3.4-4.4。9.根據權利要求1所述的一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，其特徵在於:步驟(d)中噴霧乾燥的進風溫度130-190 °C，出風溫度90-110 °C。
【專利摘要】本發明公開了一種硫酸多粘菌素E組分純化方法，涉及醫藥技術領域。本發明包括以下步驟：(a)將硫酸多粘菌素E用水溶解，上樣於凝膠介質；(b)待步驟(a)完成後用有機溶劑洗脫，分段收集、合併含硫酸多粘菌素E2和E1的洗脫液；(c)取步驟(b)中合併後的洗脫液，去除有機溶劑後用硫酸調節pH值；(d)待步驟(c)完成後噴霧乾燥，即得硫酸多粘菌素E2組分和E1組分的純化物。本發明中利用凝膠進行操作，由於其屬於惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，對多粘菌素E2和E1組分不造成任何破壞，所以最大程度的保護了多粘菌素E2和E1組分，其純化物含量可達90％。
【IPC分類】C07K7/62, C07K1/16
【公開號】CN105713074
【申請號】CN201610168114
【發明人】常國棟
【申請人】河北聖雪大成製藥有限責任公司