一種超級cik殺傷細胞的製備方法
2023-07-26 05:42:01 2
專利名稱：一種超級cik殺傷細胞的製備方法
技術領域：
本發明屬於醫療技術領域，特別是腫瘤生物技術中用於治療的殺傷細胞的製備方法。
背景技術：
腫瘤生物治療是繼手術、放療、化療之後的第四種治療方法。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells，CIK)治療是目前最有效的腫瘤生物治療手段。CIK細胞是一種體外增殖能力強、殺瘤活性高及對多重耐藥腫瘤細胞較敏感的廣譜抗瘤免疫活性細胞。
目前國內外製備的用於腫瘤免疫治療的CIK細胞是體外擴增出的以⑶3+⑶56+、CD3+ CD8+為主的異質性細胞群。該細胞群是在多種細胞因子如IL2、IFN-y及單克隆抗體(CD3McAb)的刺激下，由從外周血、骨髓或臍血中分離出來的單個核細胞在體外培養擴增而成，具有廣泛的抗腫瘤活性(Schmidt-Wolf , Negrin, Kiem, et al. : J Exp Med, 1991,174:139-149)。近年來大量關於CIK細胞的動物實驗和臨床研究證實了 CIK細胞用於腫瘤治療的前景廣闊。到目前為止，CIK細胞用於治療肝癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、結腸癌、腎細胞癌、肺癌以及各種類型白血病等取得初步成效。但是，CIK細胞治療的臨床數據也顯示出了它明顯的局限性，如它治療早期小型腫瘤效果好於晚期巨型腫瘤；它的中短期效果(無癌存活期，cancer-free survival)好於對照組,但長期效果(最終存活期，ultimate survival)卻與對照組區別不明顯。究其原因，腫瘤組織的免疫逃逸性對CIK細胞活力的削弱是其中主要原因之一。腫瘤組織的免疫逃逸性就是生物體為避免免疫細胞攻擊的一種機制。免疫T細胞包括CIK細胞，在其細胞表面表達著一類受體，它們的作用是一但與其相應的配體結合，就能產生一系列信號來抑制或削弱T細胞的活力。生物體通過這一機制來控制T細胞的活力，甚至減少其數量以避免它們攻擊自身細胞，防止產生自身免疫反應。眾所周知的細胞表面CTLA4分子就是這類受體。在免疫T細胞被激活、擴增的各個步驟中，一旦遭遇到表達著輔助激活配體(B7-1，⑶80，⑶86)的樹突細胞或腫瘤細胞時，激活的T細胞通過提高CTLA4分子的表達，使之替代⑶28與B7-1結合，從而降低T細胞的活性。CTLA4的拮抗型抗體能阻擋CLTLA4分子與B7配體的結合，從而導致了增強的T細胞活力和更強力的抗腫瘤活力。CTLA4的拮抗型抗體因而也能夠損傷正常組織對自體抗原的免疫耐受,刺激病人體內對皮膚，下垂體及小腸的免疫攻擊，造成炎症和毒性。腫瘤組織逃避殺傷細胞攻擊的方式之一就是升高其細胞表面CTLA4配體，B7-1的表達量。在腫瘤的微環境內，一旦殺傷細胞上的CTLA4與腫瘤細胞上的B7-1結合，就會使殺傷細胞產生一種能量耗盡的表象，其特徵為活力因子
(IFX；)減少，細胞數量減少，腫瘤細胞因而得到了保護。
利用拮抗型抗體來防止或破壞CTLA4與其配體B7的結合，在理論上和實驗中都已被證明能增強殺傷型T細胞的活力，也在動物和臨床試驗中證明能有效地提高免疫系統對腫瘤生長的抑制作用，甚至能引起腫瘤的壞死。但是直接靜脈注射CTLA4抗體，在達到抗腫瘤的劑量水平上也引起了非常嚴重的自身免疫反應(Hodi，O』Day et al. :N Engl J Med,2010，363:711-723)。雖然有些副反應可以用大劑量的激素藥物來控制，但有些副反應卻是致命的。而所有這些自身免疫反應是由這類抗體藥的根本藥理決定的。系統給藥，不僅激活了腫瘤組織裡的T細胞，也大大激活了全身血液循環中和各器官內T細胞，其毒副作用也非常嚴重。
發明內容
本發明的目的是提供一種製備超級殺傷細胞的方法，在體外加載CTLA4抗體以覆蓋所有細胞表面的CTLA4分子，提高殺傷細胞的殺瘤活性，降低CTLA4抗體的毒副作用。
本發明技術方案是先在體外擴增腫瘤殺傷細胞,並加載CTLA4抗體，然後清洗掉多餘的CTLA4抗體，即形成超級CIK殺傷細胞。本發明採用在體外擴增腫瘤殺傷細胞達到所需數量後，體外加載CTLA4抗體以覆蓋所有細胞表面的CTLA4分子，加載完畢後清洗掉所有多餘的CTLA4抗體。這樣製備的高活性腫瘤殺傷細胞，經過靜脈回輸後CTLA4抗體既發揮抗體藥物的療效，又避免大劑量靜脈注射CTLA4抗體導致嚴重的毒副作用。本發明方法製成的超級殺傷CIK細胞，一次靜脈回輸的細胞所需CTLA4抗體數量僅是直接靜脈注射用CTLA4抗體劑量的1%，而且靜脈回輸時的殺傷細胞將沒有自由抗體去激活體內T細胞，由此大大減低了 CTLA4抗體可能引起的自身免疫反應的副作用；同時被CTLA4抗體覆蓋的殺傷細胞將不會與B7-1結合，不會被腫瘤微環境滅活，避免腫瘤組織的免疫逃逸性，從而能夠持續對腫瘤細胞造成殺傷，最終能夠達到對腫瘤組織長效性的抑制甚至清除的目的。本發明具體包括以下步驟
1)在PBMC細胞中加入IFX-,,』在37。。,5% CO2孵箱中培養；
2)24小時後加入CD3McAb和IL-2，繼續在37。。，5% CO2孵箱中培養；
3)隨後每三天更換新培養液，並添加IL-2；
4)第九天更換液後,加入載有腫瘤抗原的樹突細胞,並加入CTLA4抗體；
5)在第12天收集超級CIK殺傷細胞時，加入CTLA4抗體，在室溫下靜置30分鐘，隨後用PBS洗滌去除游離的CTLA4抗體，最後懸浮於生理鹽水中。在所述步驟4)中，所述加入的CTLA4抗體使CTLA4抗體的終濃度到達lug/ml。本發明的有益效果是本發明方法製成超級殺傷細胞的殺傷活力可以隨著CTLA4抗體加載而提高，而且加載量只需直接靜脈注射用CTLA4抗體劑量的1%，而且回輸時的殺傷細胞將沒有游離的CTLA4抗體去激活體內T細胞，由此大大減低了 CTLA4抗體使用時引起的自身免疫反應的副作用。
圖I為超級CIK殺傷細胞製備方法的流程圖。圖2為超級CIK細胞生長活力檢測結果圖。圖3為超級CIK細胞殺傷活力檢測結果圖。
具體實施例方式下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。一、CIK細胞的製備
I、本發明的超級CIK細胞的製備，如圖I所示
(I)外周血單個核細胞(PBMC)的採集製備·
用血細胞分離機在無菌條件下採集腫瘤患者抗凝血，比重為I. 077的淋巴細胞分離液Ficoll-Paque Plus與血按1:2加入離心管中，離心1500rpm/30min,取界面層細胞，PBS洗滌2次，懸浮於無血清GT-T561培養基中，調整細胞濃度IX IO6細胞/mL。(2)製備超級CIK殺傷細胞
在當日製備的PBMC細胞中，加入IFX-·/ (1000 u ..EilL在37V ,5% CO2孵箱中培養。24 小時後加入 CD3McAb(50 ng / ml), IL-2 (300 u / ml)，繼續在 37°C，5% CO2孵箱中培養。隨後每三天更換新培養液，加IL-2 (300 u / ml)。第九天更換液後，加入10%的載有腫瘤抗原的樹突細胞，並加入CTLA4抗體(ipiIimumab,百時美施貴寶Bristol-Myers Squibb生產)使CTLA4抗體的終濃度到達Iug/ml ο在第12天收集超級CIK殺傷細胞時，加入CTLA4抗體(lug/ml)，在室溫下靜置30分鐘，隨後用PBS洗滌2次以去除游離的CTLA4抗體，最後懸浮CIK於生理鹽水中，以備靜脈回輸。2、對照組CIK殺傷細胞的製備
對照組製備CIK殺傷細胞時，除不加CTLA4抗體外，其他處理方法同上。二、超級CIK殺傷細胞和對照組CIK殺傷細胞各指標的檢測 I、無菌試驗和熱源檢測
超級CIK殺傷細胞和對照組CIK細胞的無菌試驗和熱源檢測均為陰性。2、表型檢測
用流式細胞儀檢測細胞表型，表型檢測結果，採用以上方法製備的超級CIK殺傷細胞和對照組CIK細胞中，T淋巴細胞的數量和各亞群的比例無明顯差異。T淋巴細胞(⑶3+細胞)佔細胞總數的90%以上，其中T淋巴細胞中各亞群的比例因血液來源差異有一定變化範圍CD3+CD56+細胞的比例為40% 55%，CD8+細胞的比例為65 80%，CD3-CD56+細胞的比例為25 40%。3、活細胞技術檢測
檢測方法為常規臺盼蘭(Trypan Blue)染色，顯微鏡觀察活細胞數量。
活細胞技術檢測結果超級CIK殺傷細胞和對照組CIK細胞中活細胞百分比都大於90%,無明顯差異。4、超級CIK細胞生長活力和殺傷活力檢測 採用MTT方法檢測細胞生長活力。採用IFXy ELISA方法檢測超級ClK細胞殺傷活力。I)取第12天生長的超級CIK殺傷細胞，以細胞濃度為5 X IO4 /mL，O. I mL鋪於96孔平底板中，所有樣品設3個復孔。PMA (植物血凝素)500ng/ml用於激活CIK細胞中T細胞，B7-1重組蛋白lug/ml用於模擬體內腫瘤微環境內的抑制機制來抑制T細胞活力。CTLA4抗體(ipilimumab)按終濃度l，10，100，1000，10000ng/ml加入實驗孔，用於中和B7-1對T細胞的抑制作用。96孔板放置在37°C,5% CO2培養中培養24小時後，將培
養吸出50ul用於ELISA方法檢測IPC/濃度；96孔板繼續培養48小時後，每孔加入濃度
為5mg/ml的噻唑藍(MTT) O. 02ml，繼續培養4小時，每孔加入O. Iml 二甲亞碸(DMSO)後，在570nm處測定吸光率。2)超級CIK細胞生長活力和殺傷活力檢測結果在模擬體內腫瘤微環境下，被激活的CIK細胞在接觸到B7-1時，其生長活力和殺傷活力分別被抑制到最高活力水平的30%(如圖2所示)和20% (如圖3所示)；而加入拮抗型CTLA4抗體後，阻斷了 B7-1和CIK細胞表面的CTLA4的結合，因而解除了 CTLA4信號系統引起的抑制作用，CIK細胞的生長活力(如圖2所示)和殺傷活力(如圖3所示)都得到恢復，且活力恢復程度與CTLA4抗體的劑量成正比。CIK生長活力在CTLA4抗體中高劑量(l-10ug/ml)下得以完全恢復(如圖2所示);其殺傷活力則在CTLA4抗體同等劑量下恢復了 80%的活力(如圖3所示)。由此結果可以得出以下結論常規CIK細胞(無CTLA4抗體阻斷其抑制信號系統)在進入腫瘤微環境後，其活力將受到極大地抑制；相反，本發明方法製成的超級CIK細胞(被CTLA4抗體覆蓋並阻斷其抑制信號系統)在進入腫瘤微環境後，其活力將被完好地保持，使之能夠有效而長效地殺傷腫瘤組織。
權利要求
1.一種超級CIK殺傷細胞的製備方法，其特徵在於先在體外擴增腫瘤殺傷細胞，並加載CTLA4抗體，然後清洗掉多餘的CTLA4抗體，即形成超級CIK殺傷細胞。
2.根據權利要求I所述超級CIK殺傷細胞的製備方法，其特徵在於包括以下步驟 1)在PBMC細胞中加入IFX-γ,在37°C,5% CO2孵箱中培養； 2)24小時後加入CD3McAb和IL-2，繼續在37°C>5% CO2孵箱中培養； 3)隨後每三天更換新培養液，並添加IL-2； 4)第九天更換液後,加入載有腫瘤抗原的樹突細胞,並加入CTLA4抗體； 5)在第12天收集超級CIK殺傷細胞時，加入CTLA4抗體，在室溫下靜置30分鐘，隨後用PBS洗滌去除游離的CTLA4抗體，最後懸浮於生理鹽水中。
3.根據權利要求I所述超級CIK殺傷細胞的製備方法，其特徵在於在所述步驟4)中，所述加入的CTLA4抗體使CTLA4抗體的終濃度到達lug/ml。
全文摘要
一種超級CIK殺傷細胞的製備方法，屬於醫療技術領域，本發明採用在體外擴增腫瘤殺傷細胞達到所需數量後，體外加載CTLA4抗體以覆蓋所有細胞表面的CTLA4分子，加載完畢後清洗掉所有多餘的CTLA4抗體。這樣製備的高活性腫瘤殺傷細胞，經過靜脈回輸後CTLA4抗體既發揮抗體藥物的療效，又避免大劑量靜脈注射CTLA4抗體導致嚴重的毒副作用，能夠持續對腫瘤細胞造成殺傷，最終能夠達到對腫瘤組織長效性的抑制甚至清除的目的。
文檔編號C12N5/078GK102899289SQ20121040796
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月24日 優先權日2012年10月24日
發明者胡偉明 申請人:揚州維克斯生物科技有限公司