建立針對中國人口腔白色海綿狀斑痣動物模型的實驗方法
2023-07-25 10:46:11 2
專利名稱：建立針對中國人口腔白色海綿狀斑痣動物模型的實驗方法
技術領域：
本發明涉及一種實驗技術應用於研究人類口腔黏膜病一白色海綿狀斑痣，將人 類口腔疾病轉移至動物模型上從而為該病的機制研究和治療提供有效的實驗動物的技術。
背景技術：
口腔白色海綿狀斑痣(white sponge nevus以下簡稱WSN)又稱白色折皺病，是角 蛋白基因突變引起的一種常染色體顯性遺傳病，特性為具有不規則的外顯性，個體發病率 與家族系列相比較多，棘層細胞表達蛋白K13和K4的點突變或外源鹼基的插入，導致此病 的發生。目前關於白色海綿狀斑痣的突變基因的研究，國際上共發現了 9個突變位點(其 中2個是我們發現的)，通過比較其他突變位點，我們發現該突變具有明顯的特點，即存在 顯著的家族遺傳性和人種特異性。2008年，通過研究，我們發現中國人的WSN病的致病基因 突變發生在Keratin 4基因上，突變位點為1829G — A，蛋白質E520K，從而首次在國際上揭 示了中國人此病的致病基因突變位點，但到目前為止，此疾病發生的分子機制尚不清晰，也 無有效的治療方法。為了進一步對此病進行研究，我們建立了針對中國人WSN病此突變的 轉基因動物模型，力爭為該病的機制研究和治療提供有效的實驗動物。
發明內容
為了探討WSN病發病的分子機理，我們在國際上首次建立了針對中國人的，可以 模擬人類口腔白色海綿狀斑痣臨床病理表型的K4突變的轉基因動物模型本發明提供的實 驗方法，其實驗步驟如下一、探測中國人WSN患者的突變基因位點2.用鹽析法提取WSN患者的DNA。3.設計引物K4F1 5，-GATTTGGGGGCTCCTTCAGTG-3，，K4R1 5' -GGACTCAGGACCCCTCTCTTCTAAC-3『禾ΠK4F2 5』 -GGCACTGCTGACCACCTATCTAATG-3，，K4R2 5，-GCCAAAGCCACTACTCAGGCC-3，，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增 Κ4 基因上 的目的基因。4.對擴增的Κ4基因進行測序。5.發現中國人WSN患者的基因突變位點。二、Κ4突變基因重組質粒的構建2.利用STRATAGENE公司的點突變試劑盒在質粒pCMV6_XL4_KRT4的KRT4基因 1829位上製造突變G變為A，使第520密碼子由GAG突變為AAG，胺基酸由E突變為K，PCR 及測序證明突變成功。3.構建用於連接的linker A--Mlul-Aval--Aval--BamHl--EcoRI--HindIII-A 插入到 T-vector 中，然後分別利用限制性內切酶BamH I (241bp), EcoR I (816bp), HindIII (2479bp)進行重組，產生重組 的KRT4基因。將KRT4基因利用BamHI/Hindlll插入表達載體pcDNA3. 1(+/_)，完成K4轉基因模 型重組質粒的構建。三、重組質粒轉染將重組質粒轉染至LA795鼠肺癌細胞中進行培養，發現轉染野生型cytokeratiM cDNA重組質粒的細胞表現為長梭形，轉染突變型的細胞則表現為不規則形或短梭形，說明 基因突變影響了轉染細胞中間張力絲的穩定性，從而引起細胞形態的改變。此表現證實該突變為中國人WSN病的致病突變基因。四、K4轉基因動物模型的篩選與鑑定1.用限制性內切酶PvuI將構建好的pcDNA3. 1-KRT4進行線性化，純化後進行顯微 注射，將K4基因的重組質粒導入小鼠受精卵中2.對轉基因首建鼠用PCR法進行檢測鑑定。3.將鑑定陽性的首建轉基因小鼠和非轉基因小鼠合籠，繁殖得到Fl代小鼠。4.利用聚合酶鏈式反應鑑定Fl代轉基因小鼠。5.將鑑定陽性的Fl代轉基因小鼠，通過光鏡、電鏡、Wfestern blotting、免疫組 化、免疫螢光、原位雜交等方法，證實其蛋白和臨床病理表型表現為白色海綿狀斑痣的表 現。6.證實針對中國人白色海綿狀斑痣的轉基因動物模型構建成功。藉助分子生物學和胚胎工程的技術，將人類口腔WSN相關K4突變基因在體外擴增 和加工，再導入動物的早期胚胎細胞中，使其整合到染色體上，當胚胎被移植到代孕動物的 輸卵管或子宮中後，發育成攜帶K4突變基因的轉基因動物。本發明的優點是，其針對中國家系發現的WSN基因突變位點進行實驗研究，具有 一定的針對性，唯一性。該技術周期短，成本低，特異性強，可基本表現出WSN表徵，有助於 人們對WSN疾病發生機制進行實驗研究。
下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。圖1是本發明的實驗步驟流程圖。
具體實施例方式如圖1所示，本發明的實施步驟如下首先用鹽析法提取WSN患者的DNA。設計兩對引物將DNA中K4基因上的目的基因 進行聚合酶鏈式反應(PCR)，對擴增出來的K4基因片段進行測序，發現中國人WSN患者基因 突變位點。然後利用STRATAGENE公司的點突變試劑盒在質粒pCMV6_XL4_KRT4的KRT4基因 18 位上製造突變G變為A，使胺基酸由E突變為K，PCR及測序證明突變成功。構建用於 連接的linker然後分別利用限制性內切酶進行重組，產生重組的KRT4基因。將KRT4基因 插入表達載體pcDNA3. 1 (+/-)，完成K4轉基因模型重組質粒的構建。將將重組質粒轉染至LA795鼠肺癌細胞中進行培養，證實該突變為中國人WSN病的致病突變基因。再將構建好的pcDNA3. 1-KRT4產物大量提取，線性化及純化，通過顯微注射法建 立K4基因突變轉基因小鼠模型。用聚合酶鏈式反應(PCR)對首建鼠進行目的基因檢測鑑 定，將檢測結果陽性的首建轉基因小鼠和非轉基因小鼠合籠，繁殖得到Fl代小鼠。最後對PCR技術鑑定出的陽性Fl代轉基因小鼠，通過光鏡、電鏡、 Wfesternblotting、免疫組化、免疫螢光、原位雜交等方法，證實其蛋白和臨床病理表型表現 為白色海綿狀斑痣的表現，證實針對中國人白色海綿狀斑痣的轉基因動物模型構建成功。以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非對本發明作任何形式上的限制，凡 是依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬於 本發明技術方案的範圍內。綜上所述，本發明在結構設計、使用實用性及成本效益上，完全符合產業發展所 需，且所揭示的結構亦是具有前所未有的創新構造，具有新穎性、創造性、實用性，符合有關 發明專利要件的規定，故依法提起申請。
權利要求
1. 一種建立針對中國人口腔白色海綿狀斑痣動物模型的實驗方法，其特徵在於，該實 驗方法的步驟為探測中國人WSN患者的突變基因位點(1)用鹽析法提取WSN患者的DNA；(2)設計引物K4F1 5』 -GATTTGGGGGCTCCTTCAGTG-3，， K4R1 5』 -GGACTCAGGACCCCTCTCTTCTAAC-3，禾口 K4F2 5' -GGCACTGCTGACCACCTATCTAATG-3，，K4R2 5』-GCCAAAGCCACTACTCAGGCC-3』，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增K4基因上的目 的基因；(3)對擴增的K4基因進行測序；(4)發現中國人WSN患者的基因突變位點； K4突變基因重組質粒的構建(1)利用STRATAGENE公司的點突變試劑盒在質粒pCMV6_XL4_KRT4的KRT4基因18 位上製造突變G變為A，使第520密碼子由GAG突變為AAG，胺基酸由E突變為K，PCR及測 序證明突變成功；(2)構建用於連接的linkerA--Mlul-Aval--Aval--BamHl--EcoRI--HindIII-A 插入到 T-vector 中，然後分別利 用限制性內切酶BamH I (Mlbp)、EcoRI (816bp)、HindIII (2479bp)進行重組，產生重組的 KRT4基因；將KCT4基因利用BamHI/Hindlll插入表達載體pcDNA3. 1 (+/_)，完成K4轉基因模型重 組質粒的構建； 重組質粒轉染將重組質粒轉染至LA795鼠肺癌細胞中進行培養，發現轉染野生型cytokeratiMcDNA 重組質粒的細胞表現為長梭形，轉染突變型的細胞則表現為不規則形或短梭形，說明基因 突變影響了轉染細胞中間張力絲的穩定性，從而引起細胞形態的改變； 此表現證實該突變為中國人WSN病的致病突變基因； K4轉基因動物模型的篩選與鑑定(1)用限制性內切酶PvuI將構建好的pcDNA3.1-KRT4進行線性化，純化後進行顯微注 射，將K4基因的重組質粒導入小鼠受精卵中(2)對轉基因首建鼠用PCR法進行檢測鑑定；(3)將鑑定陽性的首建轉基因小鼠和非轉基因小鼠合籠，繁殖得到Fl代小鼠；(4)利用聚合酶鏈式反應鑑定Fl代轉基因小鼠；(5)將鑑定陽性的Fl代轉基因小鼠，通過光鏡、電鏡、ffesternblotting、免疫組化、免 疫螢光、原位雜交等方法，證實其蛋白和臨床病理表型表現為白色海綿狀斑痣的表現。
全文摘要
一種建立針對中國人口腔白色海綿狀斑痣動物模型的實驗方法，該實驗方法的步驟為探測中國人WSN患者的突變基因位點，K4突變基因重組質粒的構建，重組質粒轉染，K4轉基因動物模型的篩選與鑑定。本發明針對中國家系發現的WSN基因突變位點進行實驗研究，具有一定的針對性，唯一性。該技術周期短，成本低，特異性強，可基本表現出WSN表徵，有助於人們對WSN疾病發生機制進行實驗研究。
文檔編號C12N15/85GK102102103SQ20091024481
公開日2011年6月22日 申請日期2009年12月16日 優先權日2009年12月16日
發明者張劍明 申請人:張劍明