來自粗糙脈孢菌的s-腺苷甲硫氨酸-6-n-賴氨酸-甲基轉移酶，編碼其的基因，包...的製作方法

2023-07-10 04:19:21 3

專利名稱：：來自粗糙脈孢菌的s-腺苷甲硫氨酸-6-n-賴氨酸-甲基轉移酶，編碼其的基因，包...的製作方法來自粗糙脈孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶，編碼其的基因，包含其的載體和宿主細胞，以及使用該宿主細胞生產三甲基賴氨酸的方法
背景技術：
本發明涉及從粗糙脈孢菌(A^"ra^oracrow")獲得的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移斷LMT)，編碼其的多核苷酸，包含所述多核苷酸的載體和宿主細胞，以及通過培養所述宿主細胞而生產三甲基賴氨酸的方法。L-肉鹼(3-羥基-4-三甲基氨基丁酸)，在生物體中普遍存在，並且是在線粒體中將活化的長鏈脂肪酸經由線粒體內膜攜帶到線粒體基質中的兩性離子化合物。己知在人體中L-肉鹼可以從賴氨酸或蛋白質賴氨酸合成。在哺乳動物中，蛋白質賴氨酸通常用作L-肉鹼生物合成的前體，然而，在粗糙脈孢菌中，使用游離賴氨酸。在L-肉鹼的生物合成中，形成e-N,N,N-三甲基賴氨酸，s-N,N，N-三甲基-(3-羥基賴氨酸，N，N,N-三甲基氨基丁醛中間體，和，丁醯甜菜鹼，並且推測？丁醯甜菜鹼通過Y-丁醯甜菜鹼羥化酶羥基化而成為L-肉鹼。甚至在現有技術中，當在粗糙脈孢菌從游離的賴氨酸生物合成L-肉鹼時，參與將s-N,N，N-三甲基賴氨酸轉化成L-賴氨酸的第一步反應的酶還是未知的。所述酶可以有效用來從游離的賴氨酸生產L-肉鹼。本發明的發明人已經嘗試產生應用廉價前體並且還具有高L-肉鹼生產效率的微生物，並且發現具有將來自粗糙脈孢菌的L-賴氨酸轉化成6-N-三甲基賴氨酸的活性的蛋白和基因，因此完成本發明。附圖描述圖1是顯示洗脫溶液的天然-PAGE或SDS-PAGE分析的結果的圖，所述洗脫溶液通過裂解粗糙脈孢菌培養物並且對裂解物進行DEAE柱層析而獲得。圖2是顯示在蛋白條帶a、b和c與賴氨酸和S-腺苷甲硫氨酸反應後通過HPLC測量三甲基賴氨酸的結果的圖表。圖3是顯示通過HPLC分析通過將條帶a蛋白與賴氨酸反應而獲得的樣品、條帶a與三甲基賴氨酸標準物的結果的圖表。圖4是顯示使用瓊脂糖電泳方法分析S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶基因的PCR產物的結果的圖。圖5是顯示pT7-7LMT構建的圖。圖6是顯示上清液SDS-PAGE分析結果的圖，所述上清液通過在存在IPTG時培養含有獲得於粗糙脈孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶基因的大腸桿菌(E.coli)並且將從中獲得的真菌菌體裂解而獲得。發明詳述技術問題本發明提供一種具有將來自粗糙脈孢菌的L-賴氨酸轉化成6-N-三甲基賴氨酸的活性的蛋白和編碼其的基因。本發明還提供包含所述基因的載體和宿主細胞。本發明還提供通過培養所述宿主細胞而生產三甲基賴氨酸的方法。技術方案按照本發明的一個方面，提供一種具有SEQIDNO:2的胺基酸序列和S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶活性的蛋白。按照本發明的蛋白來自於粗糙脈孢菌，具有SEQIDNO:2的胺基酸序列，並且具有S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶活性。在本發明中，"S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶活性"意欲指使用L-賴氨酸作為底物催化從L-賴氨酸形成三甲基賴氨酸的反應的活性。按照本發明的另一個方面，提供編碼SEQIDNO:2的胺基酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸的一個實例是具有SEQIDNO:1的核苷酸序列的多核苷酸。按照本發明的另一個方面，提供包含編碼SEQIDNO:2的胺基酸序列的多核苷酸的載體。在本發明中，"載體"表示可以作用為能夠遞送多核苷酸的運載工具(vehicle)的核酸構建體。所述載體，例如，衍生於質粒的載體及衍生於病毒的載體，包括在生物體中不但可以複製還可以不複製的核酸構建體。因此，術語"質粒"、"載體"及"盒"在本發明中互換地使用。另外，所述載體可以包括調節基因表達的調控序列，諸如啟動子、操縱子、mRNA核糖體結合位點和轉錄/翻譯信號、以及使得基因更容易操縱的序列。按照本發明的另一個方面，提供包含編碼SEQIDNO:2的胺基酸序列的多核苷酸的宿主細胞。所述宿主細胞可以是屬於埃希氏菌屬(Escherichiagenus)的微生物，並且優選為大腸桿菌BL21(DE3)CJ2004-1(保藏號KCCM-10637)。按照本發明的另一個方面，提供生產三甲基賴氨酸的方法，所述方法包括在存在游離賴氨酸時培養包含編碼SEQIDNO:2的胺基酸序列的多核苷酸的宿主細胞。在本發明中，所述宿主細胞可以是BL21(DE3)CJ2004-1(保藏號KCCM-10637)。培養可以在通常所用的適當的培養基和培養條件下，根據選定的宿主細胞而進行。按照本發明的方法，培養宿主細胞，然後在細胞或培養物溶液中產生S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶，並且最終將賴氨酸轉化成三甲基賴氨酸。按照本發明的方法可以用來通過將所產生的三甲基賴氨酸與同L-肉鹼的生物合成相關的酶在細胞中或在體外反應而最終產生L-肉鹼。所產生的L-肉鹼可以通過本領域的技術人員已知的常規方法進行純化。有利效果按照本發明的一個實施方案的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶可以在體外和在體內將游離的賴氨酸轉化成三甲基賴氨酸。按照本發明的一個實施方案的基因可以編碼S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶，按照本發明的一個實施方案的載體和宿主細胞表達S-腺苷甲硫氨酸-6-:^-賴氨酸-甲基轉移酶，由此有效地用於將游離的賴氨酸轉化成三甲基賴氨酸的方法。按照本發明的方法，三甲基賴氨酸可以由游離的賴氨酸而產生。最佳方式以下，將參考下列實施例更詳細地描述本發明。這些實施例僅是為了舉例說明目的並且不是意圖限制本發明的範圍。實施例實施例1:從粗糙脈孢菌蛋白分離S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶並且證實其功能培養粗糙脈孢菌，並且收集細胞。然後，將細胞使用2mMDTT和包含0.2mMEDTA的lMpH7.4的磷酸鉀緩衝液裂解，然後提取蛋白。通過向獲得的上清液中緩慢加入硫酸銨達到50%終飽和濃度而將蛋白沉澱下來，然後在離心分離之後向沉澱的蛋白加入少量0.1MpH7.4的磷酸鉀緩衝液。將溶液使用Tl透析膜進行脫鹽。脫鹽的樣品使用DEAE柱純化。在此時，通過使用0.1MpH7.4的磷酸鉀緩衝液作為洗滌緩衝液而進行洗滌，通過使用包含0.3MNaCl的0.1MpH7.4的磷酸鉀緩衝液作為洗脫緩衝液而進行洗脫，並且合併洗脫的溶液。此後，將得到的樣品使用T1透析膜脫鹽。脫鹽樣品使用CM柱純化。將0.1MpH7.4的磷酸鉀緩衝液用作所述柱的洗滌緩衝液，並且將沒有吸附到柱上並且從柱上流出的樣品都合併起來。將蛋白樣品再次加載到DEAE柱上，然後使用0.1MpH7.4的磷酸鉀緩衝液進行濃度梯度洗脫，達到0-0.3M的NAC1濃度。使用天然-PAGE和SDS-PAGE對純化的樣品進行蛋白質分析。圖1是顯示洗脫溶液的天然-PAGE或SDS-PAGE分析的結果的圖，所述洗脫的溶液在進行上文所述的純化步驟之後和在進行DEAE柱層析之後獲得。在圖1A中，泳道l代表標記，泳道2和3代表DEAE洗脫峰2的天然-PAGE分析的結果，並且泳道4和5代表DEAE洗脫峰3的天然-PAGE分析的結果。在圖1B中，泳道1代表標記，泳道2代表DEAE洗脫峰2的天然-PAGE分析的結果，泳道3代表DEAE洗脫峰3的天然-PAGE分析的結果，泳道4和5代表DEAE洗脫峰2的SDS-PAGE分析的結果，並且泳道6和7代表DEAE洗脫峰3的SDS-PAGE分析的結果。從圖1的結果，將條帶a、b和c選作LMT候選蛋白，並且測量每一蛋白的活性。首先，將與每一條帶對應的凝膠切下，然後用勻漿器將凝膠壓碎。然後，將5mllg/L賴氨酸(終濃度500mg/L)和2mllg/L甲基供體，S-腺苷甲硫氨酸，加入到獲得的產物中，並且在28'C緩慢攪拌24小時，以使用HPLC分析三甲基賴氨酸峰。圖2是顯示在蛋白條帶a、b和c與賴氨酸和S-腺苷甲硫氨酸反應後通過HPLC測量三甲基賴氨酸的結果的圖表。如在圖2中所示，在與條帶a反應的樣品中，在大約15分鐘的停留時間證實被視為三甲基賴氨酸的峰。在圖2中，1、2和3代表與每一條帶a、b和c相對應的結果。為了更準確地證實所述條帶，將通過條帶a與賴氨酸反應獲得的樣品與三甲基賴氨酸標準物進行比較。圖3是顯示通過HPLC分析通過蛋白條帶a與賴氨酸反應獲得的樣品並且將其與三甲基賴氨酸標準物比較的結果的圖表。如在圖3中所示，條帶a的峰時，S卩，電壓具有最高值的時間，與三甲基賴氨酸標準物完全一致。因此，證實條帶a包括S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶，LMT。在圖3中，1和2是指分別與標準物和條帶a相對應的結果。獨立的HPLC圖表整合在圖2和3中。接下來，分析N-端序列，以獲得LMT蛋白的胺基酸序列。首先，將在SDS-PAGE凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上，然後將蛋白條帶切下，以通過Edman方法分析N-端序列。特別地，異硫氰酸苯酯(PTC)與肽在pH值8—9和室溫反應，由此獲得其中N—端被硫代氨甲醯化的PTC-肽，然後，將PTC-肽在酸性條件下反應，以從中僅分離N-端胺基酸。分離的胺基酸用乙酸乙酯提取，用HPLC鑑定，並且分析。結果，證實N-端序列為AFGKL(SEQIDNO:5)。基於所證實的N-端胺基酸序列進行關於已知的粗糙脈孢菌的完整的基因組序列的探尋。結果，證實具有與LMT的N-端序列一致的胺基酸序列的蛋白和基因、以及核苷酸序列。實施例2:來自粗糙脈孢菌的編碼LMT的基因的證實在本實施例中，構建來自粗糙脈孢菌的cDNA文庫，並且證實其中編碼LMT的基因。(1)構建來自粗糙脈孢菌的cDNA文庫將分離自粗糙脈孢菌的mRNA作為模板，通過使用polyT作為引物的PCR而產生cDNA。使用EcoRI和Xhol，將獲得的cDNA插入到AAD5克隆載體中。接著，為了獲得質粒形式的cDNA庫，進行下述步驟將大腸桿菌BNN322在LBKm+0.2。/。麥芽糖中培養過夜；使用離心分離收集細胞；將細胞重懸在1ml10mMMgSO4溶液中；將重懸的細胞與3.5X107個包含cDNA庫的X在3CTC不攪拌地溫育30分鐘；向其中加入2mlLB培養基，並且將感染的細菌在3(TC繼續振蕩培養大於1個小時；將得到的產物塗布到LB+氨苄青黴素(75pl/ml)培養基上；並且將質粒從所產生的菌落分離，以形成cDNA文庫集合(pool)。(2)S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶(LMT)基因(lmt)的證實使用在實施例1中獲得的LMT蛋白以及關於其基因序列的信息，構建包括寡核苷酸SEQID.Nos.3和4的引物組，以擴增lmt基因。接著，使用cDNA文庫作為模板，通過使用所述引物組作為引物的PCR而擴增S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶的基因。將獲得的PCR產物通過瓊脂糖電泳進行分析。結果，證實大約0.65kb的條帶，並且通過自動鹼基序列分析而證實基因鹼基序列(SEQIDNO:1)。作為應用NCBIBLAST的搜索工具關於所分析的鹼基序列的相似信息的搜索結果，在脈孢菌(A^wms;ora)基因組序列中找到與lmt基因具有100%同一性的基因，並且證實所述基因關於其功能被視為唯一的假設蛋白。另外，S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶的胺基酸序列從所述基因序列推導為SEQIDNO:2。圖4是顯示通過瓊脂糖電泳分析S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶基因的PCR產物的結果的圖。接著，將PCR產物用A^el和^^M消化，並且連接到用相同的酶消化的pUC19中，然後用得到的產物轉化大腸桿菌DH5oc。然後，通過藍/白斑檢測而分離轉化體。結果，證實存在8-腺苷甲硫氨酸-6->^-賴氨酸-甲基轉移酶基因插入其中的質粒。實施例3:在大腸桿菌中表達S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶基因在本實施例中，構建一種大腸桿菌表達載體，以在大腸桿菌中表達來自粗糙脈孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶基因。然後，將所述載體引入到大腸桿菌中，並且確定大腸桿菌是否表達來自粗糙脈孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶基因。(1)構建大腸桿菌表達載體構建用於在大腸桿菌中表達S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶基因的pT7-7LMT載體。首先，將來自包含其的質粒的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶基因用限制性酶諸如A^eI和&m/fI消化，然後，通過在低熔點瓊脂糖凝膠上進行電泳而只將S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶基因的DNA分離並且純化。然後，將所述DNA插入到用MfeI和Bam/7I處理的pT7-7中(圖5)。圖5是表示pT7-7LMT的構建的圖。將連接混合物插入到大腸桿菌DH5cc中，並且將細菌轉化，然後在含有氨苄青黴素的固體平板培養基中分離轉化體。將重組質粒從分離的轉化體分離，並且用妮"和&附//1消化。結果，證實S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶基因的插入，並且將所述載體叫作pT7-7LMT。(2)構建其中引入pT7-7LMT的大腸桿菌BL21(DE3)將大腸桿菌BL21DE3用pT7-7LMT載體轉化。將40nI大腸桿菌BL21DE3與1|ilpT7-7LMT載體混合，置於冷的2mm縫隙的小杯中，並且在2.5kV,200Q,和25|aF的條件下通過電穿孔進行轉化。將獲得的轉化體塗布到含有氨苄青黴素的固體平板培養基上，然後將質粒從在其中所選的轉化體純化，並且用AWeI和^7m7/I消化。結果，通過證實插入的基因和質粒的大小，而證實pT7-7LMT引入到質粒中，並且將其叫作BL21(DE3)/pT7-7LMT。(3)在大腸桿菌中表達S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶為了證實S-腺苷甲硫氨酸-6->^賴氨酸-甲基轉移酶的表達，培養BL21(DE3)/pT7-7LMT，其中大腸桿菌BL21(DE3)用pT7-7LMT轉化。將BL21(DE3)/pT7-7LMT在50mlLB培養基中或在其中置有含有氨節青黴素的LB培養基的裝有擋板的250ml燒瓶中培養至0D60.6，然後在向其中加入lmMIPTG之後培養超過4個小時。以4，000xg進行離心15分鐘，並且收集細胞。然後，將細胞重懸在1ml的裂解溶液中(140mMNaCl,200g/1甘油和lmMDTT，在10mMpH7.4的磷酸鈉緩衝溶液中)。將得到的培養細胞用冰覆蓋，然後使用超聲勻槳器將細胞裂解5次，每次10秒。此後，在4。C，10，000xg進行離心20-30分鐘，然後去除細胞碎片，並且只收集上清液。通過SDS-PAGE證實約25kD的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶(圖6)。圖6是顯示上清液的SDS-PAGE分析結果的圖，其中所述上清液通過在存在IPTG時培養含有來自粗糙脈孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶基因的大腸桿菌並且將從中獲得的細菌裂解而獲得。在圖6中，泳道M是指標記，泳道1是指陰性對照，並且泳道2和3是指細胞裂解物，泳道2和3中的環形部分是指與LMT相對應的25kD的位置的條帶。實施例4:應用大腸桿菌BL21〖DE3VpT7-7LMT構建三甲基賴氨酸將在實施例2中構建的大腸桿菌BL21(DE3)/pT7-7LMT在50mlLB培養基中或在其中置有含有氨苄青黴素的LB培養基的裝有擋板的250ml燒瓶中培養至OD600.6，然後在向其中加入lmMIPTG後，在28"C再培養超過8小時，以形成酶的正確的三級結構，並且防止內含體的形成。在培養過程中，加入500mg/L的L-賴氨酸和200mg/L的S-腺苷甲硫氨酸作為反應溶液，並且測量培養溶液中的三甲基賴氨酸含量。結果在表l中顯不。在下述條件下通過HPLC測量三甲基賴氨酸。將來自Supelco的SUPELCOSILLC-DABS用作柱，A緩衝液這樣製備，以致將0.1%的三氟乙酸(TFA)加入到其中蒸餾水和乙腈以8:2比例混和的緩衝液中，並且B緩衝液這樣製備，以致將0.1X的TFA加入到其中蒸餾水和乙腈以2:8的比例混和的緩衝液中。使用線性濃度梯度方法，保持0.8ml/min的流速，分析三甲基賴氨酸。表1.tableseeoriginaldocumentpage11如在表1中所示，證實來自粗糙脈孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶的基因在大腸桿菌中表達，並且從中將L-賴氨酸轉化成三甲基賴氨酸。在本實施例中獲得的大腸桿菌BL21(DE3)/pT7-7LMT於2004年12月13日保藏在韓國微生物保藏中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms,KCCM)，其為布達佩斯條約下的國際保藏單位(保藏名BL21(DE3)CJ2004-1:保藏號KCCM-10637)。申請人或代理機構文件參考國際申請號涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細則13Z^)A.以下作出的指示涉及在說明書第1頁第1行(注中文說明書第i頁第10-11行)中提及的保藏的微生物或其它生物材料B.保藏鑑定更多的保藏在附頁上鑑定□保藏機構名稱KCCM(韓國微生物保藏中心)保藏機構地址(包/牙^_^編媽浙房家)361-221,YurimB/D,Honje1，Sudaemun，首爾，120-091,韓國保藏曰期保藏號2004年12月13日KCCM-10637C.另外的指示(^7榮^e^屑縻《)該信息在附頁上繼續□D.做出指示的指定局(力7榮^^,示^^f^^^^^Vf^^)E.指示的單獨說明(力7菜^^^^像S)以下所列指示以後將提交給國際局(規定指示例如"保藏登記號"的一般性質)僅供受理局使用□該頁與國際申請一起收到僅供國際局使用口該頁於被國際局接收。授權官員授權官員PCR/RO/134表(1998年7月)權利要求1.一種蛋白，其具有S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶活性，具有SEQIDNO2的胺基酸序列，催化從L-賴氨酸形成6-N-三甲基賴氨酸。2.—種編碼SEQIDNO:2的胺基酸序列的多核苷酸。3.權利要求2的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有SEQIDNO:1的核苷酸序列。4.一種含有權利要求2或權利要求3的多核苷酸的載體。5.—種含有權利要求2的多核苷酸的宿主細胞。6.權利要求5的宿主細胞，其中所述宿主細胞是大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)CJ2004-1(保藏號KCCM-10637)。7.—種生產三甲基賴氨酸的方法，所述方法包括在存在賴氨酸時培養按照權利要求5或權利要求6的宿主細胞。全文摘要本發明提供從粗糙脈孢菌獲得的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶，編碼其的多核苷酸，包含所述多核苷酸的載體和宿主細胞，以及通過培養所述宿主細胞而生產三甲基賴氨酸的方法。文檔編號C12P17/06GK101213307SQ200680024002公開日2008年7月2日申請日期2006年7月7日優先權日2005年7月7日發明者姜歡求,崔惠真,朱哉映,樸英薰,李炳旭,李真浩,金蕙園,高恩聖申請人:Cj第一製糖株式會社