一種以褶皺臂尾輪蟲純系進行環境監測的方法
2023-07-10 07:59:06
專利名稱：：一種以褶皺臂尾輪蟲純系進行環境監測的方法一種以褶鈹臂尾輪蟲純系進行環境監測的方法
技術領域：
-本發明涉及利用褶皺臂尾輪蟲單克隆純係為生物模型建立了一套檢測水體汙染物對生物毒性大小的方法，尤其是可以對重金屬毒性進行檢驗，屬於生物環境毒理學研究領域。
背景技術：
：對於利用生物進行環境監測的方法，國內外主要利用植物和動物對汙染物等毒性作用因子的反應來作為指標進行衡量。在植物方面，主要是以蠶豆根尖、洋蔥根尖、大蒜根尖等植物根系中的細胞微核的產生情況來進行評判，這方面國內外有大量的研究報導；在動物方面，既有用血液淋巴細胞在毒性實驗條件下出現微核的情況來評定，也有從生理生化角度，如利用魚、蝦產生應急蛋白等作為毒性檢測指標。以上研究的實驗生物材料主要是植物和體型較大的動物的血液，在水體汙染物毒性評價方面，一些學者也探討了利用輪蟲種類和數量作為環境汙染情況的指標來粗略的估計水體受汙染情況，如陳菊芳2000年在"中國環境科學雜誌"報導了水體浮遊生物(主要是輪蟲)與水質的關係，但沒有進一步查閱到在這方面實際應用於環境監測的報導，至今也未見從褶皺臂尾構建單克隆純系角度來研究環境汙染物對水體生物影響方面的報導。褶皺臂尾輪蟲單克隆純系中的所有個體由於全部來源於同一個親本，因而遺傳背景都是相同的，這樣可以最大程度的減少外界環境對受測試生物的影響，即最大程度地降低了背景，從而提高了實驗結果的可靠性。
發明內容1、褶皺臂尾輪蟲單克隆純系建立方法選擇活力較強的褶皺臂尾輪蟲單個個體，用虹吸管吸入48孔(6x8)細胞培養板中進行培養，每孔中加入lmL(即1000uL)的淡水小球藻與培養液的混合液。培養時溫度保持在25°C。經過7天的培養後，於解剖鏡下挑選活力強的子代個體10個，分別放入另一個48孔細胞培養板中進行培養，在這個轉移培養過程中逐步添加培養液，使體積達到1000uL。以上轉移後培養的輪蟲再經過7天培養，選擇其中活力強的48個輪蟲把其轉移到另一個48孔培養板中的每個孔中進行單獨培養，經過7天左右培養，可以使每個孔中的輪蟲數量達到20-30個。這些^^蟲共同組成了一個遺傳背景相同，來自一個原始^^蟲親本的單克隆純系，可以以此純系輪蟲進一步進行環境毒理實驗，以探討重金屬對輪蟲毒性影響，進而確定一套水體環境監測的生物監測方法。2、以輪蟲死亡數目衡量重金屬毒性的方法利用重金屬鎘離子(Cd2+)對以上建立的純系褶皺臂尾輪蟲進行毒性實驗。CcT濃度梯度設為0.lmg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L六個從低到高的濃度，試驗在48孔(6x8)細胞培養板中進行。用以上六種鎘離子濃度水體分別對單個克隆純系的不同平行組進行毒性試^瞼，連續培養96小時，觀察各孔中褶皺臂尾輪蟲的死亡情況。於解剖鏡(2xl0-20倍鏡)下計數，各濃度設置6組平行，2組空白對照(不加入鎘離子)，在3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、96h記錄褶鈹臂尾4侖蟲個體死亡數目、存活數。經過觀察統計，確定可以把18h時各鎘離子濃度下輪蟲的死亡數目作為指標來指示不同濃度鎘離子對水體生物的有害影響。具體實施例方式一、輪蟲採集從野外含有褶皺臂尾輪蟲的水樣中取水樣，經80目的濾網過濾水樣，由於大量枝角類不能濾過，留在濾網上，輪蟲則存在於燒杯的水體中；再用250目的濾網過濾燒杯中的水體於另一燒杯中，過濾後，4侖蟲則留在濾網上。用膠頭滴管(口徑約為0.4隨的細長玻璃吸管)吸取250目網上的液體，置於載玻片上，在解剖鏡(4x10=40倍鏡)下，用虹吸管吸取單個輪蟲，其後再放置於10x10=100倍顯微鏡下鑑別輪蟲的種類。二、輪蟲飼養選用實驗室恆溫光照培養箱中培養淡水小球藻作為褶皺臂尾輪蟲的辨料。投餵淡水小球藻時，小球藻(先濃縮置於離心管中，10000rpm,10min，倒去上清液)與輪蟲培養液(篩選出輪蟲後的水樣經過煮沸，滅菌，冷卻後成為培養褶皺臂尾輪蟲的培養液)的比例為1:50，光照強度為1000-1200lx,L:D=14:IO，培養溫度為25±1°C。三、褶皺臂尾輪蟲純系構建從採集的輪蟲樣本中，經解剖鏡鑑別，選擇活力較強的褶皺臂尾輪蟲單個個體，用虹吸管吸入48孔(6x8)細胞培養板中進行培養，每孔中加入lmL(即lOOOuL)的淡水小球藻與培養液的混合液。培養時溫度保持在25。C。經過7天的培養後，於解剖鏡下挑選活力強的子代個體10個，分別放入另一個48孔細胞培養板中進行培養，在這個轉移培養過程中逐步添加培養液，使體積恢復為1000uL。再經過7天培養，把48個輪蟲再轉移到另一個48孔培養板中的每個孔中進行培養，經過7天左右培養，可以使每個孔中的輪蟲數量達到20-30個。這些輪蟲共同組成了一個遺傳背景相同，來自一個原始輪蟲親本的單克隆純系，可以以此純系輪蟲進一步進行遺傳毒理實驗，以探討重金屬對輪蟲的毒性影響，進而確定一套水體環境監測的生物監測方法。四、鎘離子(Cd2+)毒性試驗(一)實驗條件(1)實驗中培養褶皺臂尾輪蟲的液體是淡水小球藻與培養液的混合液，其中小球藻與輪蟲培養液(篩選出輪蟲後的水樣經過煮沸，滅菌，冷卻後成為培養褶皺臂尾輪蟲的培養液)加入的比例為1:50。(2)培養容器為48孔細胞培養板，每孔中混合液的體積為1000uL。(3)光照強度為1000-1200lx,L:D=14:10;置於恆溫光照培養箱中培養，培養溫度為25土rc。(二)鎘離子(Cd2+)毒性試驗方案(1)Cd^農度梯度設為0.lmg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L，試驗在48孔(6x8)細胞培養板中進行(具體實驗設置見表1)。用以上六種鎘離子濃度水體分別對單個克隆純系的不同平行組進行毒性試驗，連續培養96小時，觀察各孔中褶皺臂尾輪蟲的死亡情況。於解剖鏡(2x10=20倍鏡)下計數，各濃度設置6組平行，2組￡白對照(不加入鏑禹於)，在3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、96h記錄褶皺臂尾輪蟲個體死亡數目、存活數。表lCcT濃度梯度設置(單位毫克/升)tableseeoriginaldocumentpage6(2)每孔中實際加入鎘離子體積公式:tableseeoriginaldocumentpage6(三)實驗結果經過96小時連續觀察，確定第18小時為統計數據資料的最佳時間，此時最高濃度(Cd"農度4.Omg/L)的培養孔中，輪蟲出現了最大死亡數目的峰值，而其後，如24小時時，此培養孔中輪蟲則全部死亡。表318h褶皺臂尾輪蟲的死亡計數(單位個)tableseeoriginaldocumentpage6tableseeoriginaldocumentpage7五、統計分析結果以表3中鎘離子毒性處理18小時時各鎘離子濃度下輪蟲的死亡數目為觀測值，對各鎘離子濃度間的處理效應有無進行方差分析，並進行多重比較。結果表明，0.lmg/L和0.2mg/L鎘離子濃度間差異不顯著，而其它處理間均存在著極顯著差異。說明鎘離子濃度含量在0.2mg/L以下的水體為衡量鎘離子對生物汙染的最高安全濃度。由此方法可以依次制定其它重金屬等汙染物在水體中的安全濃度等指標。權利要求1、褶皺臂尾輪蟲單克隆純系建立方法選擇活力較強的褶皺臂尾輪蟲單個個體，用虹吸管吸入48孔(6×8)細胞培養板中進行培養，每孔中加入1mL(即1000uL)的淡水小球藻與培養液的混合液。培養時溫度保持在25℃。經過7天的培養後，於解剖鏡下挑選活力強的子代個體10個，分別放入另一個48孔細胞培養板中進行培養，在這個轉移培養過程中逐步添加培養液，使體積恢復為1000uL。再經過7天培養，分別轉移輪蟲到另一個48孔細胞培養板中進行擴大培養，由此可以建立一個遺傳背景相同，來自一個原始輪蟲親本的單克隆純系。2、以輪蟲死亡數目衡量重金屬毒性的方法利用重金屬鎘離子(Cd2+)對以上建立的純系褶皺臂尾輪蟲進行毒性實驗，Cc^+濃度梯度設為0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L六個從低到高的濃度，試驗在48孔(6X8)細胞培養板中進行。用以上六種鎘離子濃度水體分別對輪蟲單個克隆純系的不同平行組進行毒性試驗，連續培養96小時，觀察各孔中褶皺臂尾輪蟲的死亡情況。於解剖鏡(2X10=20倍鏡)下計數，各濃度設置6組平行，2組空白對照(不加入鎘離T)，在3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、96h記錄褶鮍臂尾輪蟲個體死亡數目、存活數。以18h時各鎘離子濃度下輪蟲的死亡數目為觀測值，對各鎘離子濃度間的處理效應有無進行方差分析檢驗，並進行多重比較。全文摘要本發明是一種以褶皺臂尾輪蟲純系進行環境監測的方法，即利用一種水體浮遊生物(褶皺臂尾輪蟲)建立一個水體環境汙染物毒性的監測方法，屬於環境生物學領域，其特徵在於以純系輪蟲作為受試模型來檢測諸如重金屬鎘(本發明以檢測鎘離子毒性來說明此方法的具體應用)的最高安全濃度。其技術方案要點是，首先利用單個輪蟲親本培育出由一定數量子代輪蟲組成的純系，這樣可以保證受試生物的遺傳背景相同，提高檢測的準確性，其次利用不同鎘離子濃度梯度對這些純系進行分組毒性實驗，檢測結果表明，18小時時可以作為鎘離子在水體中對於生物產生毒害的檢驗時間點，鎘離子濃度在0.2mg/L以下屬於安全濃度。此發明可以為制定水體汙染物的安全濃度提供生物毒性實驗材料和科學依據。文檔編號G01N33/18GK101162224SQ200710132448公開日2008年4月16日申請日期2007年9月17日優先權日2007年9月17日發明者靜徐,閻斌倫,陳建華,煥高申請人:淮海工學院