一種降糖作用化合物的應用的製作方法

2023-07-10 11:25:07

本發明涉及藥物領域，具體涉及天然藥物降糖領域，尤其涉及抑制α-葡萄糖苷酶作用及促進脂肪細胞葡萄糖吸收的化合物及用途。
背景技術：
：糖尿病是一種由遺傳和環境因素相互作用而引起的臨床症候群，系因胰島素分泌不足或胰島素作用受損引起機體糖、脂肪、蛋白質、水和電解質等一系列代謝紊亂，臨床以高血糖為主要標誌。其表現為血液及尿液中葡萄糖濃度異常升高，血糖、尿糖過高時可出現典型的三高一少症狀。久病可引起多系統損害，病情嚴重或應激時可發生急性代謝紊亂如酮症酸中毒等。由於α-葡萄糖苷酶抑制劑可與α-葡萄糖苷酶上的碳水化合物的結合點相結合，其親和力遠大於酶的正常底物，因此，當與膳食一起進食後，α-葡萄糖苷酶抑制劑可與小腸上皮細胞刷緣處的寡糖相競爭，佔據α-葡萄糖苷酶上寡糖結合位點，使寡糖吸收受阻，減少寡糖在小腸上部的消化，未被消化的碳水化合物被運送至小腸中下段及結腸，導致碳水化合物的消化吸收發生在整個小腸中，延緩和延長了餐後葡萄糖的吸收，從而降低餐後血糖增高。目前已經被批准為臨床治糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要有3種：阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，他們都是含氮的生物鹼。它們通過減少餐後血糖濃度從而減少蛋白糖基化，延遲或阻止腎、視網膜神經病變發生以及缺血性心肌病的發展。文獻報導主要α-葡萄糖苷酶抑制劑有多糖、生物鹼、苷類、多肽、糖苷類、黃酮類、皂苷和酚類等。技術實現要素：本發明提供丁香亭在製備降糖組合物中的用途，本發明提供丁香亭製備抑制α-葡萄糖苷酶的組合物中的用途。本發明提供丁香亭在製備抑制α-葡萄糖苷酶的降糖組合物中的用途。本發明提供丁香亭在製備抑制α-葡萄糖苷酶的降糖組合物中的用途，其用量範圍是1-625-200μM。本發明提供丁香亭製備促進脂肪細胞葡萄糖吸收的組合物中的用途。本發明提供丁香亭在製備促進脂肪細胞葡萄糖吸收的降糖組合物中的用途。本發明提供丁香亭在製備促進脂肪細胞葡萄糖吸收的降糖組合物中的用途，其用量範圍是1-20μM。本發明提供丁香亭在製備抑制和促進脂肪細胞葡萄糖吸收的降糖組合物中的用途。本發明提供丁香亭在製備降糖組合物中的用途，其製藥劑型是：片劑、膠囊劑、注射劑、凍幹注射劑。藥效學實驗證明，本發明的化合物及其組合物對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制作用、促進脂肪細胞葡萄糖吸收作用。其中α-葡萄糖苷酶可以是來源於人、酵母、大米、芽胞桿菌的α-葡萄糖苷酶。本發明提供的化合物及其組合物具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制作用和促進脂肪細胞葡萄糖吸收作用，具有避免現有降糖藥物不良反應的潛力，為其應用提供了新的途徑。試驗例1丁香亭的α-葡萄糖苷酶活性測試4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitropHenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG)是麥芽糖類似物。以pNPG為底物測定中草藥提取物或降糖活性成分對α-葡萄糖苷酶抑制活性大小，從中草藥中篩選強活性降糖活性因子是目前最常用、最經典的篩選方法。α-葡萄糖苷酶加入酶反應底物(pNPG)後，底物被酶催化分解為對硝基苯酚(PNP)和葡萄糖，PNP是一種有色物質，在400nm左右有最大吸收，可以用酶標儀測定。由於產物的量與樣品中被測物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺測得不同的OD值，由此得出樣品的抑制活性。通過對不同濃度抑制劑和相應抑制率作回歸方程，可得半數抑制濃度(IC50)。試劑與耗材：α-葡萄糖苷酶(美國Sigma公司)、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(美國Sigma公司)、DMSO(美國Sigma公司)、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O(江蘇南京化學試劑有限公司)、96孔板(美國Coming公司)儀器：BioTek多功能酶標儀、KH-500DB型數控超聲波清洗器、SPX智能型生化培養箱、Thermo十二通道移液器緩衝液配製：磷酸鹽緩衝液(PBS)取NaH2PO4·2H2O3.978g，Na2HPO4·12H2O8.771g，用1000ml蒸餾水定容，即得pH＝6.8，0.1mol/L磷酸緩衝液(PBS)。用酶標儀進行凝血酶抑制活性測試的一般步驟如下：於96孔板中依次加入50μL 磷酸鹽緩衝液(0.05mol/L)，40μLα-葡萄糖苷酶溶液(3.0U/ml)和10μL不同濃度的樣品溶液，在37℃條件下孵育半小時。然後加入100μLpNPG溶液(1.0mM)，再次反應半小時後再405nm下測定反應混合物隨時間變化的吸光度值。每組實驗均重複3次，IC50值取其平均值。取阿卡波糖做為陽性對照。α-葡萄糖苷酶可以是來源於人、酵母、大米、芽胞桿菌的α-葡萄糖苷酶。抑制率(％)＝(Acontrol-Asample)/Acontrol×100本實驗採取阿卡波糖為陽性對照，測得IC50值為93.91μM，如表1所示，2009年，LiYQ等用pNPG為底物體外篩選α-葡萄糖苷酶活性，測得阿卡波糖抑制率為91μM，實驗結果與文獻報導相近(LiYQetal，JAgricFoodChem.2009；57(24)：11463-8.)，證明測試體系可靠。表1：阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用濃度(μM)抑制率(％)SD6.256.5045053.56252412.514.990994.0727831.2526.031191.22119462.543.964362.12326212558.462961.06695825068.934520.42465250079.509931.831187100086.231130.92715本實驗稱取丁香亭粉末溶於二甲基亞碸中，製成200mM的母液貯存，使用時稀釋1000倍，至終濃度為200μM，再依次稀釋至終濃度100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.625μM，測定α-葡萄糖苷酶抑制率。表2：丁香亭對α-葡萄糖苷酶的抑制作用濃度(μM)抑制率(％)SD1.6255.2924343.287353.1251.905930.8448756.255.7832312.20057612.58.3680981.1941622525.546012.4696435068.049084.02404110096.865033.92023720098.328082.320103數據處理使用GrapHPadPrism6.02軟體。丁香亭對α-葡萄糖苷酶的抑制曲線見圖1，IC50為36.81μM。附圖說明圖1：丁香亭的IC50曲線圖。圖2：丁香亭能促進正常脂肪細胞對葡萄糖的吸收利用圖1的坐標的具體解釋圖1的橫坐標的中文含義：丁香亭的濃度(μM)的對數值圖1的縱坐標的中文含義：丁香亭的抑制百分數，單位(％)圖2的坐標的具體解釋圖2的橫坐標的中文含義：給藥濃度(μM)圖2的縱坐標的中文含義：葡萄糖的吸收量(mM)試驗例2脂肪組織、肝臟、骨骼肌是利用葡萄糖的主要組織，脂肪細胞對葡萄糖的吸收利用可有效降低血液中的葡萄糖，脂肪細胞對葡萄糖的吸收能力是衡量藥物降糖作用的重要指標。本實驗以二甲雙胍作為陽性藥，驗證丁香亭能促進正常脂肪細胞對葡萄糖的吸收利用。試劑與耗材：二甲雙胍、HEPES、地塞米松、胰島素(美國Sigma公司)、牛血清白蛋白(BSA)(美國羅氏製藥有限公司)DMEM培養基(美國Gibco公司)、葡萄糖、NaCl、KCl、CaCl2、KH2PO4、MgSO4·7H2O(國藥集團化學試劑有限公司)。儀器：thermo二氧化碳培養箱、BioTek多功能酶標儀、SPX智能型生化培養箱緩衝液配製：KRHB緩衝液：Krebs-RingerpHospHate-HEPESbuffer：NaCl118mmol/L，KCl5mmol/L，CaCl21.3mmol/L，KH2PO41.2mmol/L，MgSO4·7H2O1.2mmol/L，HEPES30mmol/Land0.5％BSA，pH7.4。細胞株3T3-L1，前脂肪細胞，中國科學院上海生命科學院細胞庫。3T3-L1細胞的培養、傳代1.培養條件：3T3-L1前脂肪細用含10％FBS的DMEM高糖培養基復甦傳代後，接種於75mL培養瓶，在37℃、5％CO2培養箱中靜置培養。2.更換培養基：每1-2天以肉眼和倒置顯微鏡觀察脂肪細胞及培養基，若有特徵性變化，例如pH降低，培養基顏色發生明顯改變，則要更換新鮮的培養基，再將脂肪細胞重新放入溫箱中培養。3.細胞傳代：接種後3-5天後，細胞單層密集生長至80％-90％融合時，用0.25％的胰蛋白酶消化至胞質回縮、細胞間隙增大，立即倒胰酶，加入2mL的10％FBS的DMEM培養基終止消化，輕柔的吹散並收集懸浮細胞，離心、重懸、計數、均勻的接種於新培養瓶中。3T3-L1細胞的凍存、復甦1.細胞凍存：選用生長良好的脂肪細胞，緻密度為80％-90％時凍存，在凍存前一天要更換新鮮的含10％FBS的高糖DMEM。用0.25％的胰蛋白酶把脂肪細胞消化並收集於離心管中，按濃度加入配製好的凍存液(DMEM∶FBS∶DMSO＝6∶3∶1)重懸，均勻分裝入無菌凍存管中，於-70℃中凍存。2.細胞復甦：將凍存管從-70℃低溫冰箱中取出來，迅速投入37-38℃水浴中，輕搖使其在1min內快速融化。然後加入10倍體積的10％FBS的高糖DMEM培養基與之混合稀釋，低速離心收集懸浮細胞。加入適當體積的用培養基稀釋，置於37℃培養箱中培養，次日換液。3T3-L1細胞的分化細胞分化：在3T3-L1前脂肪細胞生長至細胞融合時，將10％FBS的高糖DMEM換成分化液(含0.5μM的IBMX，1M地塞米松，10μg/mL胰島素，10％FBS的高糖DMEM培養基)培養2d，更換新鮮分化液(含10μg/mL胰島素)再分化2d，隨後以含10％FBS的高糖DMEM培養基繼續培養，每2d更換一次培養基，誘導分化 8～12天後，待3T3-L1細胞呈成熟脂肪細胞表形即可用於試驗。丁香亭對生理狀態下脂肪細胞糖消耗的影響選用生長狀態良好且分化好的脂肪細胞，以2×105cell/孔接種於48孔培養板，待細胞生長至80％-90％融合時，換用不含糖的KRHB液培養4h，使細胞同步化。PBS輕洗兩遍後，每孔加入200μLKRHB。實驗分組如下：空白組，丁香亭組(0.1、1、10、20μM)和Metformin(1mM)溫育30min後，加入葡萄糖(終濃度為11mM)於37℃繼續孵育4h。孵育4h後，用葡萄糖測定試劑盒測定加入葡萄糖4h後細胞上清液中剩餘葡萄糖的含量，通過計算葡萄糖濃度差值即為脂肪細胞對葡萄糖的消耗量。統計學分析採用GrapHPadPrism-6.02統計軟體(GrapHPadSoftware，USA)進行統計分析和圖表處理。假手術與模型兩組均數比較採用雙尾t檢驗，其餘各組兩均數間比較採用單因素方差分析(ANOVA)，以Dunnett’spost-hot檢驗進一步檢測組間顯著性差異。以P＜0.05作為具有顯著性差異，P＜0.001為具有非常顯著性差異。實驗結果脂肪細胞對葡萄糖的吸收利用可有效降低血液中的葡萄糖，脂肪細胞對葡萄糖的吸收能力是衡量藥物降糖作用的重要指標。由圖2及表3可知，陽性藥二甲雙胍可顯著促進脂肪細胞的葡萄糖吸收(P＜0.001)，說明模型穩定可靠。由圖2和表3可知，丁香亭在1μM、10μM、20μM時可劑量依耐性地促進脂肪細胞對葡萄糖的吸收，與空白對照組比具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.001)。說明丁香亭在1-20μM時能促進脂肪細胞對葡萄糖的吸收，有很好的降糖作用。表3：丁香亭促進脂肪細胞對葡萄糖的吸收具體實施方式實施例1一種含有丁香亭的溶液：丁香亭2.0g，亞硫酸鈉4.0g，聚維酮10.0g，乙醇50ml，加水定容只1000mL；製備工藝：將丁香亭分散在乙醇中，亞硫酸鈉溶於水中，在超聲或攪拌條件下將拿硫酸鈉溶液逐漸加入丁香亭中，使成澄清透明溶液；加聚維酮，攪拌使溶劑，補加水定容至足量；經0.22μM微孔濾膜過濾，分裝封口。實施例2一種含有丁香亭的溶液：丁香亭1.0g，煙醯胺2.0g，乙醇200ml，加水定容至1000ml；製備工藝：將丁香亭和煙醯胺溶於乙醇中，在超聲或攪拌下逐漸加入注射用水混勻使成澄清透明溶液；經0.22μM微孔濾膜過濾，分裝封口。實施例3一種含有丁香亭的凍乾粉：丁香亭2.0g，亞硫酸鈉4.0g，聚維酮10.0g，乙醇50ml，加水定容只1000mL；製備工藝：將丁香亭分散在乙醇中，亞硫酸鈉溶於水中，在超聲或攪拌條件下將拿硫酸鈉溶液逐漸加入丁香亭中，使成澄清透明溶液；加聚維酮，攪拌使溶劑，補加水定容至足量；經0.22μM微孔濾膜過濾，冷凍乾燥得到。實施例4一種含有丁香亭的凍乾粉：丁香亭1.0g，煙醯胺2.0g，乙醇200ml，加水定容至1000ml；製備工藝：將丁香亭和煙醯胺溶於乙醇中，在超聲或攪拌下逐漸加入注射用水混勻使成澄清透明溶液；經0.22μM微孔濾膜過濾，冷凍乾燥得到。實施例5一種含有丁香亭的片劑：丁香亭20mg，澱粉88g，硬脂酸鎂3g；製備工藝：取丁香亭，加澱粉、硬脂酸鎂混合均勻，製成顆粒，乾燥，壓片，即得。實施例6一種含有丁香亭的膠囊：丁香亭20mg，澱粉88g，硬脂酸鎂2g；製備工藝：取丁香亭，加澱粉、硬脂酸鎂混合均勻，製成顆粒，乾燥，裝膠囊，即得。實施例7：一種含有丁香亭的軟膠囊：丁香亭20mg，大豆卵磷脂100g；製備工藝：取丁香亭，加大豆軟磷脂，膠體磨混勻，抽真空，壓制，即得軟膠囊。除上述實施外，本發明還可以有其他實施方式。凡採用等同替換或等效變換形成的技術方案，均落在本發明要求的保護範圍。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp