一種脫細胞生物羊膜的製備方法與流程
2023-08-03 02:33:16 2
發明設涉及生物材料領域，具體設計一種同種異體植入性生物材料的製備方法。
背景技術：
羊膜是胎膜的最內層，屬於生物膜中的一種，是一類天然細胞外基質類生物衍生材料。羊膜由滋養細胞層分化而來，表面光滑，半透明，有韌性及彈性，厚度為0.02-0.50mm，主要由I、III 型纖維膠原蛋白構成，含有少量的VI、V 型膠原，其中含有多種生長因子，如成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)、轉移生長因子-β(transforming growth-β，TGF-β)、促進血管生成的血管內皮生長因子(VEGF)，還含有纖維連接蛋白(fibronectin,FN) 等。羊膜不表達HLA-A、B、C 及DR 抗原或β2 微球蛋白，透明且無血管、淋巴和神經組織，其抗原性遠低於普通組織。大量研究表明，羊膜具有良好的細胞相容性和組織相容性，並具有部位特異的組織再生能力，為一新型的生物衍生材料。
羊膜作為生物材料應用於基礎及臨床已經有多年的歷史。早在20 世紀初期就有用含羊膜的胎膜供體移植於燒傷和潰瘍創面的報導，隨後在顱腦外科、腹腔外科、婦產科及眼科均有其應用的報導。具體來說其主要用途有：①用於眼睛表面疾病如角膜修復、先天性青光眼、角膜潰瘍等；②用於修補鼓膜損傷；③用於外科手術後預防粘連；④用於燒傷後表面覆蓋等。
然而，目前對羊膜的處理大多含有使用機械力刮除方法，使羊膜存在細胞殘留、機械性能不足以及降解周期較短等缺陷，限制了其臨床應用範圍。根據臨床報導，由於羊膜細胞的存在，在眼科，羊膜植片可能會發生植片排斥反應、植片脫落、移位溶解、感染等併發症，其安全性存在一定的風險。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種脫細胞生物羊膜的製備方法，摒棄了傳統的機械力刮除的方法，採用了相對溫和的化學處理方法，一方面能有效、徹底地除去羊膜中細胞殘留等免疫原，另一方面還能較好的保留羊膜的生物活性和生物力學性能。
本發明的技術方案是：一種脫細胞生物羊膜的製備方法，包括羊膜的清洗、化學處理和冷凍乾燥，其特徵在於，該方法按以下步驟進行：
（1）將新鮮羊膜用生理鹽水反覆清洗，直至無殘留血液；
（2）將步驟（1）所得的羊膜用過氧化氫溶液浸泡2小時；
（3）將步驟（2）所得的羊膜用分析純的丙酮浸泡，水浴恆溫震蕩脫去脂肪成分；
（4）將步驟（3）所得的羊膜用十二烷基硫酸鈉溶液浸泡16-20小時；
（5）將步驟（4）所得的羊膜用酒精浸泡16-20小時；
（6）將步驟（5）所得的羊膜用大量純化水反覆清洗至末道清洗液pH值為6.5-7.5；
（7）將步驟（6）所得的羊膜放入-70℃下的環境中冷凍16-25小時；
（8）將步驟（7）所得的羊膜放入冷凍乾燥機中進行冷凍乾燥；
（9）將步驟（8）所得的羊膜進行輻照滅菌。
根據本發明的脫細胞生物羊膜的製備方法，較好的是，所述過氧化氫的質量分數為5%-25%。
根據本發明的脫細胞生物羊膜的製備方法，在一個優選的實施方案中，所述水浴恆溫震蕩的溫度為25-37℃。
步驟（4）中所述十二烷基硫酸鈉的質量分數為0.1%-0.5%。
根據本發明的脫細胞生物羊膜的製備方法，較好的是，所述酒精的質量分數為75-85%。
根據本發明的脫細胞生物羊膜的製備方法，在一個優選的實施方案中，所述冷凍乾燥時間為24小時。
根據本發明的脫細胞生物羊膜的製備方法，較好的是，所述輻照滅菌的劑量為20-30kGy。
本發明的技術原理：摒棄了機械力刮除的傳統方法，採用了相對溫和的化學處理的方法，可以有效地除去羊膜中的上皮細胞層、纖維母細胞層和海綿層，達到消除或減弱抗原性的目的，從而減弱羊膜在移植時引起的免疫排斥反應；同時又能有效地保留基底膜中的各種膠原蛋白，可以較好地保留羊膜的生物活性。另外採用輻照的方式滅菌，能夠進一步降低羊膜的免疫原性，使植入的羊膜能夠被宿主細胞所適應，大大降低免疫排斥反應。
本發明的有益效果在於將新鮮羊膜用生理鹽水清洗乾淨，洗去羊膜上的殘留血液，再依次用過氧化氫、丙酮、十二烷基硫酸鈉、酒精處理，能夠有效地去除羊膜中的細胞膜和細胞基質等免疫原，大大降低了羊膜的免疫原性，同時通過深低溫冷凍和冷凍乾燥處理，可以進一步的降低羊膜的免疫原性，一方面能夠降低免疫排斥反應，另一方面還能較好的保留羊膜的生物活性和生物力學性能。此外，本發明設計的化學處理方法步驟簡單移行，有利於實現規模化生產操作。
具體實施方式
為使本領域技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
實施例1
將新鮮羊膜先用大量生理鹽水衝洗至無殘留血跡，將其放入質量體積比為5:1的、質量分數為5%的過氧化氫溶液中浸泡2小時；然後羊膜放入質量體積比為5:1的分析純的丙酮中，水浴恆溫震蕩2小時，脫去脂肪成分；再將所得的羊膜用質量體積比為5:1的、質量分數為0.15%的十二烷基硫酸鈉溶液浸泡18小時；再用質量體積比為5:1的、質量分數為75%的酒精浸泡18小時脫去水分後用大量的純化水反覆衝洗羊膜直至末道清洗液的pH值在6.5-7.5之間。
將清洗完成後的羊膜平鋪在不鏽鋼凍幹盤上面，放入-70℃以下的環境中冷凍24小時，然後將其放入冷凍乾燥機中進行冷凍乾燥。冷凍乾燥結束後在萬級潔淨環境中將其分割和包裝，最後將其進行輻照滅菌（劑量為25kGy）,即可得到脫細胞生物羊膜成品。
實施例2
將新鮮羊膜先用大量生理鹽水衝洗至無殘留血跡，將其放入質量體積比為6:1的、質量分數為5%的過氧化氫溶液中浸泡2小時；然後羊膜放入質量體積比為6:1的分析純的丙酮中，水浴恆溫震蕩2小時，脫去脂肪成分；再將所得的羊膜用質量體積比為6:1的、質量分數為0.2%的十二烷基硫酸鈉溶液浸泡18小時；再用質量體積比為5:1的、質量分數為75%的酒精浸泡18小時脫去水分後用大量的純化水反覆衝洗羊膜直至末道清洗液的pH值在6.5-7.5之間。
將清洗完成後的羊膜平鋪在不鏽鋼凍幹盤上面，放入-70℃以下的環境中冷凍24小時，然後將其放入冷凍乾燥機中進行冷凍乾燥。冷凍乾燥結束後在萬級潔淨環境中將其分割和包裝，最後將其進行輻照滅菌（劑量為25kGy）,即可得到脫細胞生物羊膜成品。
實施例3
將新鮮羊膜先用大量生理鹽水衝洗至無殘留血跡，將其放入質量體積比為6:1的、質量分數為10%的過氧化氫溶液中浸泡2小時；然後羊膜放入質量體積比為6:1的分析純的丙酮中，水浴恆溫震蕩2小時，脫去脂肪成分；再將所得的羊膜用質量體積比為6:1的、質量分數為0.25%的十二烷基硫酸鈉溶液浸泡18小時；再用質量體積比為5:1的、質量分數為75%的酒精浸泡18小時脫去水分後用大量的純化水反覆衝洗羊膜直至末道清洗液的pH值在6.5-7.5之間。
將清洗完成後的羊膜平鋪在不鏽鋼凍幹盤上面，放入-70℃以下的環境中冷凍24小時，然後將其放入冷凍乾燥機中進行冷凍乾燥。冷凍乾燥結束後在萬級潔淨環境中將其分割和包裝，最後將其進行輻照滅菌（劑量為25kGy）,即可得到脫細胞生物羊膜成品。