一種降低半靜態養殖水中毒死蜱誘導斑馬魚死亡率的方法與流程

2023-08-03 18:48:41 2

本發明涉及水產品養殖技術領域，尤其涉及一種降低半靜態養殖水中毒死蜱誘導斑馬魚死亡率的方法。

背景技術：

高毒有機磷農藥的替代品種毒死蜱被廣泛用於農業生產和草坪殺蟲劑，已造成環境水體汙染。毒死蜱對人類屬於中低毒農藥，但是魚類的敏感類農藥。毒死蜱屬於神經毒劑，其功能之一是抑制機體內神經中乙醯膽鹼酯酶AChE或膽鹼酯酶ChE的活性，破壞正常的神經衝動傳導，引起斑馬魚中毒死亡。另外，機體在正常情況下，體內氧自由基處於動態平衡狀態。 一旦氧自由基在機體內失去平衡，如超過了細胞抗氧化防護的能力，則會造成氧脅迫。研究表明，達到半致死濃度的毒死蜱會破壞機體氧自由基平衡，形成氧化脅迫，造成機體損傷、死亡。

對於斑馬魚，如果血清中毒死蜱濃度升高，酶活性將會降低，解毒功能下降。魚類有機磷農藥中毒，多用「阿託品」灑入養殖水中進行解毒，降低致死率。但是「阿託品」易於魚體內聚集，具有明顯的生理副作用。同時如果滯留在養殖廢水中，擴散到其他環境介質，易造成環境危害。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是一種來源於植物的多酚化合物，具有抗氧化、抗癌、抗突變等生理活性，這些功效歸結於他們對氧自由基的清除能力。研究表明EGCG具有與腸、肝、和肺中的其他酶共同阻止某些有害物質的活力，保護機體。最新研究證明EGCG可能具有神經保護功能。到目前為止， EGCG仍然被認為是具有環境友好性的純天然試劑。

斑馬魚是生態和環境指示性生物，在生態、環境和毒理等方面極具研究價值，同時又具有觀賞性等其他用途，其養殖通常在小體積半靜態水中進行。

技術實現要素：

本發明提供了一種降低半靜態養殖水中毒死蜱誘導斑馬魚死亡率的方法，採用EGCG降低水中毒死蜱誘導斑馬魚死亡率 。本發明針對半靜態水中斑馬魚對毒死蜱的暴露，檢測、調控水中毒死蜱的濃度，通過添加EGCG，調整半靜態水中EGCG與毒死蜱濃度比 ，來降低斑馬魚的死亡率。發明方法簡單易行，可提高斑馬魚暴露於毒死蜱的存活率，避免使用化學解毒劑帶來的後續副作用，提高養殖的經濟效益；同時避免排放廢水中化學解毒劑的二次汙染，提高環境經濟效益。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種降低半靜態養殖水中毒死蜱誘導斑馬魚死亡率的方法，其特徵在於： 在含有毒死蜱的半靜態養殖水中添加適量的EGCG ，使得養殖水中EGCG與毒死蜱的濃度比=（1-2）：1，所述的毒死蜱在水中的濃度為0.48-0.70 mg/L 。

所述的一種降低半靜態養殖水中毒死蜱誘導斑馬魚死亡率的方法，其特徵在於，具體操作步驟如下：

（1）取適量養殖水，測量水中毒死蜱母體起始濃度、pH值、水溫，調整養殖水的pH=6.8~8.5，控制水溫為18～25℃；

（2）根據步驟（1）測量得到的水中毒死蜱母體起始濃度，然後按比例加水稀釋至毒死蜱的濃度為0.48-0.70mg/L， 在按比例向養殖水中加入已預先配製好的高濃度EGCG水溶液，使水中EGCG與毒死蜱的濃度比=（1-2）：1， 其中，最佳配比為 EGCG：毒死蜱=（0.5-1.0）：0.5，（mg/L：mg/L），即可有效控制斑馬魚死亡，達到降低半靜態養殖水中毒死蜱誘導斑馬魚死亡率的目的。

所述高濃度EGCG溶液是指由純度≥90%的EGCG粉狀固體配製成濃度≥5.0g/L的EGCG溶液。

本發明涉及利用純植物提取劑EGCG的配比和使用方法，降低水中斑馬魚對毒死蜱的暴露死亡率。相關研究實驗如下：

配製高濃度毒死蜱和EGCG的溶液，逐級稀釋用於添加試劑。供試生物選室內馴養7d以上，自然死亡率小於2%，平均體長2~3cm的斑馬魚。試驗前一天停止餵食。實驗將供試魚分為三組（Gn（1、2、3）），每組按照EGCG與毒死蜱的不同配比，分不同水平（GnL（1、2、3…7 ））。每組每個水平設3個平行樣，並設置相應的對照組，用已曝氣的水進行處理。實驗觀察到，72小時處理過程中毒死蜱與EGCG配比組，水環境pH值變化在7.6~8.1之間。觀察24、48、72h後的死亡率，提取72h處理後斑馬魚頭部的乙醯膽鹼酯酶和肝臟的穀胱甘肽進行測定。

實驗結果表明：

1斑馬魚死亡率變化：72小時馴養實驗結果表明，斑馬魚的毒死蜱半致死濃度為0.5mg/L，EGCG沒有誘導死亡。水中含有0.5mg/L的毒死蜱時，斑馬魚的死亡率分別是：24h為40%；48h和72h均為60%。添加不同比例的EGCG後，斑馬魚的死亡率明顯降低。EGCG與毒死蜱的配比在0.25：1至4：1之間，EGCG均可以降低斑馬魚72小時內死亡率。但是不同配比，降低的程度不同。0.25：1至0.5：1之間倍比，死亡率從低配比的50%向高配比的死亡率20%逐漸降低；配比為1：1至 2：1時，72h內的死亡率均為0%；3至4倍比時死亡率為10%。實驗表明存在EGCG與毒死蜱的最佳配比範圍內，最大限度的降低斑馬魚死亡率； EGCG降低毒死蜱致斑馬魚死亡率有最佳配比範圍，即EGCG：毒死蜱（mg/L: mg/L）= 1：1至2：1之間。同時當水中毒死蜱分別為0.6、0.7mg/L時，添加EGCG也有效的降低了斑馬魚死亡率。

2斑馬魚腦部AChE變化：斑馬魚腦部乙醯膽鹼酯酶活性測定表明，比較毒死蜱存在時斑馬魚腦部AChE，EGCG的出現極大的提高了斑馬魚腦部AChE的濃度。 0.5mg/L毒死蜱濃度水平下，斑馬魚AChE濃度為3.8U/ mgprot，添加0.25：1至4.0：1之間的不同配比EGCG， AChE濃度基本按照遞增規律上升，最高至14.00 U/ mgprot（EGCG：毒死蜱=2:1），之後略有下降，但仍維持在12.00 U/ mgprot。相較於沒有添加EGCG，EGCG的出現提高AChE的濃度最高達368%。同時，這個AChE的水平變化與相應的斑馬魚死亡率相對應。0.6mg/L毒死蜱濃度水平下，雖然斑馬魚死亡率變化成波狀不穩定的趨勢，AChE的變化也基本與之相呼應。說明，EGCG對斑馬魚腦部AChE的濃度提高是影響斑馬魚死亡率的重要原因之一，並且在一定濃度的毒死蜱水平下作用有效。

3穀胱甘肽酶活性變化：0.5mg/L毒死蜱濃度降低了87.6%穀胱甘肽酶的活性濃度值。但是添加了不同配比水平的EGCG，改善了穀胱甘肽酶受毒死蜱抑制的狀況，提高了穀胱甘肽酶的活性。這種提高不是隨著EGCG配比的增加而增加，而是呈現不穩定的趨勢。EGCG：毒死蜱=1:2（EGCG濃度為0.25mg/L）提高的比率達到最大值88.7%，另一個峰值是EGCG：毒死蜱=4:1（EGCG濃度為2.0mg/L），提高率達86.5%。

0.6mg/L，0.7mg/L毒死蜱濃度水平時，添加EGCG同樣不同程度的提高了穀胱甘肽酶活性，並且和0.5mg/L水平一樣，影響沒有一定的規律。0.6mg/L毒死蜱，添加EGCG使EGCG：毒死蜱=1:4，提高92.0%的穀胱甘肽酶活性；另一個峰值為EGCG：毒死蜱=3:1，提高94.6%，達到最大。0.7mg/L毒死水平下，EGCG提高穀胱甘肽酶活性比率較小，峰值在EGCG：毒死蜱=1:2，和EGCG：毒死蜱=3:1處。

乙醯膽鹼酯酶和穀胱甘肽酶均是有機磷農藥和其他汙染物的靶標物質。養殖水中注入與誘導斑馬魚死亡的毒死蜱具有一定配比的EGCG後，明顯提高了被毒死蜱抑制的斑馬魚的乙醯膽鹼酯酶的活性，抑制了毒死蜱誘導的斑馬魚腦部毒性；同時提高斑馬魚肝部穀胱甘肽酶活性，提高機體抗氧化力，抑制毒死蜱誘導的斑馬魚肝部毒性。這些影響可能降低了因毒死蜱誘導的水中斑馬魚的死亡率。

本發明對半靜態水中斑馬魚對毒死蜱的暴露，檢測、調控水中毒死蜱的濃度，通過添加EGCG試劑，調整 EGCG與水中毒死蜱的濃度比，達到降低斑馬魚的死亡率。發明方法通過原位或異位技術實施，簡單易行，可提高斑馬魚暴露於毒死蜱的存活率，避免使用化學解毒劑帶來的後續副作用，提高養殖的經濟效益；同時避免排放廢水中化學解毒劑的二次汙染，提高環境經濟效益。

附圖說明

圖 1為養殖單元處理示意圖。

圖2 為 0.5 mg/L 毒死蜱暴露下不同暴露時間和EGCG配比死亡率。

具體實施方式

實施例：

1 一個如圖1所示的處理單元。單元體積為0.5 m3 ，EGCG配製裝置。設取樣口（取水樣測定毒死蜱濃度），進水口，多孔進EGCG溶液口，攪拌裝置等。

2 進水毒死蜱濃度調節由進水部分完成：依據測定的原水毒死蜱濃度，原水由進水口1輸入，一定體積比例的稀釋水由進水口2輸入，混合併稀釋後，使進水毒死蜱濃度為0.5mg/l , 輸入處理單元。

3 EGCG注入方式1：單點重力注入，將EGCG注入稀釋水中，共同由進水管輸入，依賴水的流動混合後，共同注入處理單元。EGCG注入方式2：多孔重力注入，由EGCG配製設備通過多點位直接將EGCG注入處理單元，設多個溶液注入口。 兩種方法均啟動緩速攪拌，20min內，將EGCG與水混合均勻，達到EGCG：毒死蜱= 1：1至2：1之間的配比要求。

圖2表明0.5mg/l 毒死蜱水平下，EGCG和毒死蜱的不同配比作用時， EGCG （mg/l）：毒死蜱（mg/l）=0.5：0.5至1.0：0.5之間斑馬魚的死亡率最低。