高效液相法精製河豚毒素的方法

2023-08-03 17:18:36

專利名稱：高效液相法精製河豚毒素的方法
技術領域：
本發明涉及一種能獲得高純度河豚毒素的方法。
一種高效液相法精製河豚毒素的方法，其特徵是先稱取標準品和河豚毒素粗品製成稀醋酸水溶液，得到標準樣品的色譜圖和粗品的製備圖，用分析/半製備型高效液相色譜儀控制流速和進樣量，根據已建立的標準條件確定製備條件的毒素峰，收集製備色譜中對應峰的流出液，調節pH值，析出結晶，將該結晶先後用稀氨水、乙醇洗滌，然後將結晶溶於稀醋酸中；再用稀氨水調節pH，出結晶；如此反覆數次；將獲得的結晶乾燥。
本發明能防止產品異構化，確保TTX的活性，減少損失，並且不需要貴重試劑，杜絕了帶入背景雜質的可能，確保了TTX的純度，操作簡便，避免使用過多的毒性試劑，比較安全，流動相的條件簡單，成本低。


及
具體實施例方式
附圖1為河豚毒素標準品的色譜圖。
附圖2為半製備條件的色譜圖準確稱取河豚毒素(TTX)標準品2.00mg，溶於10ml醋酸水溶液，製成儲備液，該標準品的濃度為0.2mg/ml。進樣，得到標準品的色譜圖(圖1)。稱取河豚毒素粗品20mg溶於2ml 2％(重量百分濃度)稀醋酸水溶液，手動向色譜柱進樣，進樣量200μl，流速為3.0ml/min。根據分析條件確定製備條件的毒素峰，以圖2的色譜圖作為製備條件，主峰為毒素峰，並用小鼠法輔助驗證毒素峰的位置，收集對應峰的流出液，得到毒液46ml。該流出液經冷凍乾燥，經氨水純化析出TTX晶體。反覆經氨水和乙醇洗滌再結晶4次，經真空乾燥得到TTX純品15.58mg，經定量分析確認純度可達99.0％。並經核磁共振和質譜驗證了河豚毒素的分子結構。
本發明的分析和半製備條件為WATERS公司600 E分析/半製備型高效液相色譜儀，大連依利特Hypersil反相C18色譜柱，規格為250*4.6mmi.d.和250*10.0mm，流動相為醋酸水溶液。確定流速為2.0ml/min、進樣體積20μl和200μl，檢測波長為195nm。
本發明中所述的醋酸水溶液濃度為0.1-5％，所述的流速範圍為0.2-10ml/min，向色譜柱進樣量的範圍10-5000μl。
由於河豚毒素結構具有一個胍基，在水溶液中呈弱鹼性，(pKa值為8.76)能與酸(如醋酸、苦味酸、檸檬酸)成鹽，加弱鹼能游離出TTX。本發明利用此性質，將河豚毒素溶於一定濃度的醋酸中，經HPLC分離，分離的峰經檢測確定出有毒位置。
權利要求
1.一種高效液相法精製河豚毒素的方法，其特徵是先稱取標準品和河豚毒素粗品製成稀醋酸水溶液，得到標準樣品的色譜圖和粗品的製備圖；用分析/半製備型高效液相色譜儀控制流速和進樣量，根據已建立的標準條件確定製備條件的毒素峰，收集製備色譜中對應峰的流出液，調節pH值，析出結晶；將該結晶先後用稀氨水、乙醇洗滌，然後將結晶溶於稀醋酸中，再用稀氨水調節pH，出結晶，如此反覆數次；將獲得的結晶乾燥。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵是所述的醋酸水溶液濃度為0.1-5％。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵是所述的控制流速範圍為0.2-10ml/min，向色譜柱進樣量範圍為10-5000μl。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵是所述的調節pH值的範圍為8.0-10.0。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵是所述的色譜柱為反相C18柱。
全文摘要
一種高效液相法精製河豚毒素的方法，其特徵是先稱取標準品和河豚毒素粗品製成稀醋酸水溶液，得到標準樣品的色譜圖和粗品的製備圖。用分析/半製備型高效液相色譜儀控制流速和進樣量，根據已建立的標準條件確定製備條件的毒素峰，收集製備色譜中對應峰的流出液，調節pH值，析出結晶，將該結晶先後用稀氨水、乙醇洗滌，然後將結晶溶於稀醋酸中，再用稀氨水調節pH，出結晶，如此反覆數次；將獲得的結晶乾燥。本發明能防止產品異構化，確保TTX的活性，減少損失，並且不需要貴重試劑，杜絕了帶入背景雜質的可能，確保了TTX的純度，操作簡便，避免使用過多的毒性試劑，比較安全，流動相的條件簡單，成本低。
文檔編號C07D491/22GK1470514SQ0313870
公開日2004年1月28日 申請日期2003年6月24日 優先權日2003年6月24日
發明者宮慶禮, 崔建洲, 王仁芳, 閻承璋, 黃海龍, 車兆東 申請人:中國海洋大學