脂質的分級方法與流程
2023-08-03 23:10:06 1
本發明涉及從微生物生物質進行脂質分級的方法，進一步詳細而言，涉及利用液化二甲醚在萃取脂質時的分離選擇性進行脂質分級的方法。
背景技術：
作為從微生物生物質萃取脂質的方法，以往已知並廣泛利用的是使用己烷等有機溶劑的溶劑萃取、利用超臨界二氧化碳的萃取等各種萃取技術。例如，已知渦鞭毛藻(Dinoflagellate)中的寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)、網粘菌(Labyrinthulea)中的海洋壺菌(Aurantiochytrium limacinum)(也稱為裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum))、絲狀真菌中的高山被孢黴(Mortierellaalpina)等微生物生產含有二十二碳六烯酸、花生四烯酸等有用的高度不飽和脂肪酸的脂質。由這些微生物生產的含有高度不飽和脂肪酸的脂質已經有多家企業在實際生產，廣泛用於嬰兒用奶粉添加用途、食品配合用途。在製造這些脂質時，已知有通過使用己烷等有機溶劑的溶劑萃取法而從細胞進行萃取的方法(非專利文獻1)。此外，已知通過對作為微藻類之一的綠藻中的雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)控制培養條件，從而在休眠細胞(包囊細胞)中以高濃度蓄積蝦青素，這種利用藻類生產蝦青素的方法也已經由多家企業實際應用，但在從細胞萃取時，進行的是使用丙酮等有機溶劑的溶劑萃取(專利文獻1)、利用超臨界二氧化碳的萃取(非專利文獻2)。
與如上所述的現有萃取方法並行的、近年引起注目的方法是，使用液化二甲醚(以下也稱為DME)作為溶劑的萃取方法。該方法具有不需要乾燥生物質、不需要破碎細胞、不需要除去萃取中所使用的有機溶劑等特徵(專利文獻2、3)。使用液化二甲醚的萃取方法由於不經歷原料的乾燥、不經歷從萃取物除去溶劑等需要加熱的工序，因此在用於例如從微生物生物質萃取脂質時，脂質的氧化被抑制到最低限度，能夠製造高品質的脂質。此外，由於省略了乾燥、破碎、除溶劑所需要的能量，因此能夠以更低的能耗來製造脂質。
現有技術文獻
專利文獻
專利文獻1：日本專利第4934272號
專利文獻2：日本特開2010-240609號
專利文獻3：日本特開2011-031170號
非專利文獻
非專利文獻1：James Wynn,Paul Behrens,Anand Sundararajan,Joe Hansen,and Kirk Apt,Production of Single Cell Oils by Dinoflagellates,in Single Cell Oils,Zvi Cohen,and Colin Ratledge,eds.,AOCS Press,Champaign,Illinois,2005,pp.86-98；
非專利文獻2：岡村俊宏：食品工業,Vol.50,No.6,p.56-62,光琳(2007)。
技術實現要素：
發明要解決的課題
該專利文獻2的使用液化二甲醚作為溶劑的萃取方法是從對象材料萃取可萃取的全部油分的技術。
本發明人想到，能否將這種使用液化DME進行的萃取用於脂質分級中，進而發現了本發明。即，本申請發明的課題在於，提供一種使用液化DME作為溶劑的脂質分級方法。
用於解決課題的手段
本發明人發現，以微生物生物質為對象，使用迄今尚不知道具有對脂質的分離選擇性的液化二甲醚作為溶劑進行萃取，將萃取物經時地分級，結果分級物的脂肪酸組成經時地發生變化，從而完成了本發明。即，本發明的目的在於，提供一種從微生物生物質進行的脂質的新的分級方法。
本發明的主旨為以下的(1)～(7)中記載的方法。
(1)一種對脂質進行分級的方法，其將微生物生物質供於使用液化二甲醚作為溶劑的萃取，利用對脂質的分離選擇性將脂質分級。
(2)一種改變微生物生物質中殘留的脂質的脂肪酸組成的方法，通過將微生物生物質供於使用液化二甲醚作為溶劑的萃取，利用對脂質的分離選擇性將部分脂質分級，從而改變微生物生物質中殘留的脂質的脂肪酸組成。
(3)一種製造脂質的方法，其特徵在於，從通過(2)的方法獲得的脂肪酸組成已改變的微生物生物質進一步萃取脂肪酸組成已改變的脂質。
(4)根據(1)～(3)中任一項所述的方法，其特徵在於，微生物生物質為培養屬於網粘菌(Labyrinthulea)綱的微生物而獲得的生物質。
(5)根據(4)所述的方法，其中，網粘菌綱為海洋壺菌(Aurantiochytrium)屬的網粘菌綱。
(6)根據(1)～(3)中任一項所述的方法，其特徵在於，微生物生物質為培養屬於綠藻綱的微生物而獲得的生物質。
(7)根據(6)所述的方法，其中，綠藻綱為紅球藻(Haematococcus)屬的綠藻綱。
發明的效果
根據本發明，能夠提供一種以液化DME為溶劑的、從微生物生物質進行的脂質的新的分級方法。例如，僅使用液化DME進行分級，就能夠將含有較多飽和脂肪酸的脂質與含有較多高度不飽和脂肪酸的脂質分離。
附圖說明
圖1為示出本發明中使用的裝置的1個方式的示意圖。
具體實施方式
本發明是在獲取微生物生物質的菌體內所含的脂質時，利用液化DME對脂質的選擇性的差異，將脂質分級。
本發明中使用的液化DME(IUPAC名：甲氧基甲烷)的沸點為-23.6℃，因此在常溫下為氣體。將其製成液體而用作本發明的溶劑。為了將DME液化，可以在壓力0.25～1.14MPa、溫度0～50℃左右的範圍內進行適當調節。
本發明中，微生物是指其菌體內生產脂質的微生物。可以例示出例如屬於隱甲藻(Crypthecodinium)屬、破囊壺菌(Thraustochytrium)屬、裂殖壺菌(Schizochytrium)屬、吾肯氏壺菌(Ulkenia)屬、Japonochytrium屬、海壺菌(Haliphthoros)屬、被孢黴(Mortierella)屬、青黴(Penicillium)屬、麴黴(Aspergillus)屬、紅酵母(Rhodotorula)屬、鐮孢(Fusarium)屬的微生物。具體而言，可以例示出渦鞭毛藻中的寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)、網粘菌中的海洋壺菌(Aurantiochytrium limacinum)(也稱為裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum))、絲狀真菌中的高山被孢黴(Mortierella alpina)等微生物，綠藻中的雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)。
本發明中，脂質是指微生物所生產的脂質，主要為甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯、磷脂、游離脂肪酸、甾醇類、烴等。進而，蝦青素等類胡蘿蔔素那樣的、包含於微生物生產的脂質中的色素等成分也能夠與脂質一起分級。
鍵合於脂質的脂肪酸的組成根據微生物不同而不同，通常以各種各樣的比率含有碳數為12～24、雙鍵數為0～6的脂肪酸。有生理活性而被認為有用的脂肪酸是高度不飽和脂肪酸，高度不飽和脂肪酸是指碳數為18以上、雙鍵數為3以上的脂肪酸，更優選碳數為20以上、雙鍵數為3以上的脂肪酸。具體而言，可以例示出α-亞麻酸(18：3，n-3)、γ-亞麻酸(18：3，n-6)、花生四烯酸(20：4，n-6)、二均-γ-亞麻酸(20：3，n-6)、二十碳五烯酸(20：5，n-3)、二十二碳五烯酸(22：5，n-6)、二十二碳六烯酸(22：6，n-3)等。
在微生物菌體中的脂質中，這些脂肪酸是作為甘油三酯、磷脂等的構成脂肪酸而鍵合。
利用液化DME的分離選擇性的最簡單的方法如下：將微生物菌體填充到柱中，使液化DME以一定速度流過該柱而將流出液分級的方法。如實施例所示，液化DME在從微生物菌體溶出脂質時具有選擇性。
含有飽和脂肪酸的脂質溶出快，含有高度不飽和脂肪酸的脂質溶出慢。利用該差異能夠提高全部脂肪酸中包含的高度不飽和脂肪酸的濃度。不使用柱，而是通過分批處理，反覆用少量的液化DME萃取也能夠實現同樣效果。此外，還可以使用發揮同樣效果的任意裝置。
以往，從微生物菌體進行溶劑萃取時，例如利用己烷進行高效萃取，但由於己烷對脂質的分離選擇性低，因此所萃取的中性脂質的脂肪酸組成與微生物生物質中的中性脂質的脂肪酸組成基本相同。如果要對所萃取的脂質中的高度不飽和脂肪酸進行濃縮，則是在萃取後另外進行純化工序。作為改變脂肪酸組成的純化方法，已知有脲加成法、冬化(wintering)法、精密蒸餾法、利用脂肪酶的濃縮法等，均為基於分子量、不飽和鍵數這樣的脂肪酸性狀差異來改變脂肪酸組成的方法。
根據本發明的方法，能夠在從微生物菌體進行萃取的階段進行一定程度的濃縮。在進行本發明的分離後，還可以進一步使用上述的以往純化方法。
利用上述分離選擇性，還能夠利用液化DME從微生物菌體選擇性地萃取除去飽和脂肪酸等不需要的脂肪酸，然後用己烷等萃取殘存的全部脂質。
通過利用液化DME進行分級，蝦青素那樣的包含於脂質中的色素也與含有較多該色素的脂質一起被濃縮，能夠直接以濃縮色素形式使用，或者，還可以進一步應用利用超臨界二氧化碳進行萃取等的蝦青素純化方法進行純化。
以下記載本發明的實施例，但本發明不限於此。
將實施例中使用的萃取裝置的構成示於圖1。將填充微生物的萃取柱(HPG-10-5，耐壓硝子工業株式會社制，180mm×26mm(內徑))的出口側與儲藏容器(HPG-96-3，耐壓硝子工業株式會社制，容量96cm3)用不鏽鋼管連接。萃取柱和儲藏容器包含使用了玻璃和聚碳酸酯的耐壓容器。將液化二甲醚由二甲醚儲槽輸送到填充有微生物菌體的萃取柱，來自萃取柱的萃取液被回收到儲藏容器內。進行規定時間的萃取後，打開儲藏容器的減壓閥，使二甲醚氣化而將其除去，將殘留的萃取物與水的混合物回收。
實施例1
從網粘菌萃取脂質
用GY培養基(將30g葡萄糖、10g酵母萃取物溶解於50％濃度的人工海水1L中，調節為pH 7.0)培養屬於網粘菌綱的微生物海洋壺菌(Aurantiochytrium limacinum)的種菌。培養中使用50mL的三角燒瓶，在其中加入30mL的GY培養基，一邊以100rpm振蕩一邊在28℃培養3天。通過離心分離從該培養液回收菌體，將回收的菌體用蒸餾水洗滌而除去培養基成分後，進一步通過離心分離回收菌體。將回收的菌體進行冷凍乾燥，獲得微生物生物質。獲得的微生物生物質用-20℃的冰箱保存直至進行萃取。
在冷凍乾燥的微生物生物質0.33g中加入蒸餾水1.263g並充分攪拌，將由此得到的樣品用圖1的萃取裝置一邊分級一邊萃取。此時，將液化二甲醚的流量設為5mL/min。萃取柱的溫度設為20℃，壓力為0.51MPa。需要說明的是，之所以在微生物生物質中加入蒸餾水而使其呈含水狀態，目的在於再現與從培養液回收的菌體相近的狀態。期間不進行以破碎細胞為目的的操作。
關於萃取液，按照表1中記載的各時間而進行分級。將通入液化二甲醚而獲得的各級分恢復到常溫、常壓，從而使二甲醚氣化，由此從各級分中的萃取物除去二甲醚。進而，通過使乾燥氣體(本實施例中使用二甲醚)與萃取物充分接觸而從各級分中的萃取物除去水分，獲得表1中記載的量的油。
[表1]
注)級分編號為1～6的油的重量為實測值，合計重量為計算值。
利用如上獲得的各油製備脂肪酸甲酯，供於利用氣相色譜的脂肪酸組成分析。分析中，使用氣相色譜：Agilent Technologies 7890A GC System，柱：J&W DB-WAX(內徑0.25mm×長度30m，膜厚0.25μm)，在下述條件下進行分析：柱溫度(升溫條件)為140℃→240℃(4℃/分鐘)，在240℃保持10分鐘，載氣為He(1.05ml/min)。將其結果示於表2。獲得了各油的脂肪酸組成差異較大的結果，由此可知，以液化二甲醚為溶劑的萃取方法具有對脂質的分離選擇性。
關於表2的級分編號為1和2的油，脂肪酸組成中的棕櫚酸(C16:0)的值為約80％，極高。這是比本實施例的全部級分的油相加時的棕櫚酸的脂肪酸組成還要高的值。因此可知，以液化二甲醚為溶劑的萃取方法是能夠使含有被期待作為生物燃料的棕櫚酸的脂質的比例提高的分級方法。
此外顯示，表2的級分編號3、4、5的油的DHA的脂肪酸組成是比本實施例的全部級分的油相加時的DHA的脂肪酸組成還要高的值。因此可知，以液化二甲醚為溶劑的萃取方法是能夠使含有DHA的脂質的比例提高的分級方法。
[表2]
注)級分編號為1～6的油的脂肪酸組成為實測值，
合計的脂肪酸組成為基於重量比的計算值。
實施例2
通過使用二甲醚進行選擇性萃取而獲得DHA濃度已濃縮的微生物油的方法
根據實施例1的結果，認為能夠從微生物生物質選擇性萃取除去C16：0等，使DHA等殘留在生物質中。
實施例1中使用的微生物生物質中含有表3的「原料」一欄中記載的油。對該生物質僅進行萃取至表2的級分編號2為止。這樣一來，在計算時，生物質中殘留有表3的「萃取後生物質」所示組成的油脂。
如表3所示，可知通過利用以液化二甲醚為溶劑的萃取方法來萃取含有棕櫚酸的脂質的比例高的脂質，能夠提高含有微生物生物質中的其它脂肪酸例如DHA的脂質的比例。
使用該微生物生物質作為進一步萃取的原料，用己烷那樣的對脂質的分離選擇性低的溶劑進行萃取，從而能夠高效地萃取含有DHA的脂質的比例已提高的脂質。
[表3]
實施例3
從紅球藻萃取脂質
將購自BIOGENIC株式會社的紅球藻乾燥生物質(雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)，BM070828，未破碎品)作為微生物生物質供於萃取。在微生物生物質0.403g中加入蒸餾水2.317g並充分攪拌，將由此得到的樣品供於使用圖1的萃取裝置的萃取。此時，將液化二甲醚的流量設為10mL/min。萃取柱的溫度設為20℃，壓力為0.51MPa。期間不進行以細胞的破碎為目的的操作。將進行與實施例1同樣的操作而獲得的油的量示於表4，此外將對這些油進行脂肪酸組成分析而得到的結果示於表5。獲得了各油的脂肪酸組成差異較大的結果，與實施例1同樣地，可知以液化二甲醚為溶劑的萃取方法具有對脂質的分離選擇性。
由實施例1及本實施例的結果可知，以液化二甲醚為溶劑、利用對脂質的分離選擇性將脂質分級的方法能夠不依賴於微生物種類而進行應用。
[表4]
[表5]
通過HPLC法測定實施例3中獲得的各油中的蝦青素的重量。蝦青素標準品及各油溶解於丙酮：氯仿＝2：1，供於分析。分析條件如下(柱：COSMOSIL 250×4.6mm(i.d.),5C18-MS-PAQ類型(Nacalai Tesque株式會社制)；檢測器：智能紫外可見檢測器UV-2075plus(日本分光株式會社制)；流動相：甲醇:四氫呋喃＝9:1；流速：1.5mL/min；檢測：470nm)。將結果示於表6。此外，表6中還記載了目視確認的各油的色調。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是屬於綠藻綱的微藻類，含有脂溶性色素即葉綠素(綠色)作為光合成色素。此外知道：其包囊細胞中確實高濃度地蓄積作為脂溶性色素的蝦青素(橙紅色)。通過以液化二甲醚為溶劑的萃取而獲得的各油的色調明顯不同，由此確認液化二甲醚對這些脂溶性色素也具有分離選擇性。利用該性質，能夠降低例如葉綠素，其結果是能夠提供一種製造呈更鮮豔的橙紅色的含有蝦青素的油的方法。
[表6]
產業上的利用可能性
根據本發明，能夠從含有有用的高度不飽和脂肪酸的微生物生物質萃取脂質，同時能夠將含有較多飽和脂肪酸的脂質與含有較多高度不飽和脂肪酸的脂質分級。提供一種將液化二甲醚並非單純地作為萃取溶劑、而是作為一邊分級一邊萃取的溶劑來使用的方法。