絞股藍總皂甙酸水解產物中分離的化合物的製作方法

2023-08-03 23:35:01 1

專利名稱：：絞股藍總皂甙酸水解產物中分離的化合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種化合物，是一種絞股藍總皂甙酸水解產物中分離的化合物，該化合物為一個新的化合物，對乳腺管癌細胞(MDA-MB-435)具有細胞毒活性。
背景技術：
：癌症一直是不能攻克的世界難題，從天然產物中尋找抗癌活性成分是解決這個世界難題的有效途徑之一。絞股藍為多年生落葉草質藤本絞股藍屬植物，因為其所富含的各種活性成分，尤其是皂甙類成分而被作為傳統的中藥以及開發成現代保健品。在創新藥物研究過程中，其關鍵的切入點是必須發現生物活性先導物，這是創新藥物的前提。由於天然產物本身在自然界常常儲量有限，化學合成大多涉及長路線、低收率的複雜操作，因此，以天然產物為起點，建立分子多樣性和結構複雜性的"類天然產物"化合物庫，從中發現活性先導化合物而創製新藥仍是世界藥學工作者公認的有效途徑之一。水解產物豐富了分子多樣性和結構複雜性並保持了天然產物的某些特性，因而有望成為產生高質量先導結構的理想方法。
發明內容本發明的目的在於，提供一種絞股藍總皂甙水解產物中分離的化合物，經鑑定以及生物活性試驗證明，該化合物是一種新的化合物，具有抗癌活性，可作為製備抗癌藥物被應用。為了實現上述任務，本發明採取如下的技術解決方案一種絞股藍總皂甙酸水解產物中分離的化合物，特徵在於，其結構式為:2928該化合物的名稱為(3P，23S)腸3畫hydroxyda腿ar隱20，24國dien國21國oicacid21，23-lactone，分子式為C3。H4603，分子量為454。上述絞股藍總皂甙酸水解產物中分離的化合物的分離方法，其特徵在於，按如下步驟進行1)絞股藍總皂甙的水解取300g絞股藍總皂甙，溶解在5000ml的乙醇中，然後加入500ml鹽酸，6(TC水浴回流8小時，減壓濃縮揮幹乙醇，通過大孔樹脂柱，樹脂柱先用大量的水洗，再用80%的乙醇洗脫，收集80%的乙醇洗脫液濃縮得到80g水解產物；2)水解產物的分離純化水解產物通過矽膠柱層析、凝膠柱層析、反相柱層析分離提取其中的化學成分，常壓柱層析採用溼法裝柱和矽膠拌樣上柱，根據薄層展開情況選擇洗脫溶劑系統，反相柱層析採用加壓裝置，凝膠柱層析選用SephadexLH-20，多次柱層析，最後得到化合物(3J3，23S)-3-hydroxydammar-20，24-dien-21-oicacid21，23-lactone。經申請人所進行的鑑定以及生物活性試驗證明，該化合物對乳腺管癌細胞(MDA-MB-435)具有細胞毒活性，能夠用於製備抗癌藥物的應用。圖1是絞股藍總皂甙酸水解產物化學成分提取分離流程圖；圖2是豐示題化合物(3(3，23S)-3-hydroxydammar-20，24-dien國21國oicacid21，23-lactone的關鍵HMBC和NOE特徵關係；圖3-圖11是標題化合物的結構鑑定圖，其中圖3是標題化合物^NMR，圖4是標題化合物13CNMR(DEPT)，圖5-6是標題化合物的HSQC;圖7-8是標題化合物HMBC;圖9-10是標題化合物的H-HCOSY;圖11是標題化合物的NOESY。以下結合附圖對本發明作進一步的詳細描述。具體實施例方式本發明通過對絞股藍皂苷的水解，分離純化水解產物，鑑定結構，活性測定，以求發現結構新穎的化合物和活性先導物，例如抗癌活性先導物。本發明為一種絞股藍總皂甙酸水解產物中分離得到具有抗癌活性的新化合物。絞股藍總皂甙(純度98%)購自西安天一生物技術有限公司。細胞毒活性試驗是在廈門大學完成。上述材料均為公開的生物材料。主要利用的試劑為鹽酸，乙醇，石油醚(60—90°C)，三氯甲烷，丙酮，甲醇等，均為分析純。其分離過程如下1.絞股藍總皂甙的水解取300g絞股藍總皂甙，溶解在5000ml的乙醇中，然後加入500ml鹽酸，60'C水浴回流8小時，減壓濃縮揮幹乙醇，通過大孔樹脂柱，樹脂柱先用大量的水洗，再用80%的乙醇洗脫，收集80%的乙醇洗脫液濃縮得到80g水解產物。水解條件為HCl/EtOHl:10,6(TC加熱反應8小時。2.化合物的分離純化參見圖1，水解產物通過矽膠柱層析、凝膠柱層析、反相柱層析分離提取其中的化學成分，常壓柱層析採用溼法裝柱和矽膠拌樣上柱，根據薄層展開情況選擇洗脫溶劑系統，反相柱層析採用加壓裝置，凝膠柱層析選用SephadexLH-20，多次柱層析最後得到化合物。具體步驟為水解產物浸膏80g幹法拌樣(100-200目)，250g矽膠(200-300目)，用氯仿-甲醇=100:0,氯仿_甲醇=50:1，氯仿_甲醇=30:1，氯仿-甲醇=20:1，氯仿-甲醇=10:1，氯仿-甲醇=8:2梯度洗脫，每份洗脫液為300ml，減壓蒸餾濃縮，薄板檢測，相似合併，得到五個組分；其中Fr2組分顯示較強的細胞毒活性，Fr2組分繼續用矽膠柱層析氯仿-甲醇-水二9:1:0.1洗脫，得到四個組分，在活性追蹤下對Fr2.2用甲醇-水二70:30，用甲醇-水=80:20，用甲醇-水=90:10進行反相柱層析(RP-18)及一次凝膠SephadexLH-20柱層析(氯仿_甲醇=1:1)，得到活性化合物。將得到的活性化合物做薄層層析，經紫外，碘和硫酸-乙醇顯色為單一斑點，三種溶劑系統展開均為單一斑點，可初步認定為單一化合物。3.化合物的鑑定對分離到的化合物做質譜，碳譜，氫譜，以及二維核磁共振。化合物(3P，23S)國3國hydroxydammar畫20，24-dien-21-oicacid21，23-lactone為白色，可溶解於氯仿，比旋光度為[a產D+87.5(CHCl3;c0.25)。由核磁共振譜數據(見表1，圖3-圖12)和高分辨質譜得出分子式為C30H46O3，分子量為454，査閱參考文獻，然後綜合分析得到的數據，並結合文獻對照分析化合物的可能結構類型，最後根據物理特性和譜學特徵確定標題化合物結構為formulaseeoriginaldocumentpage8命名為(3j3，23S)-3-hydroxydammar-20，24國dien-21-oicadd21,23-lactone，結構經過多個資料庫査新，發現國內外尚沒有此化合物的報導，可確定此化合物為新的化合物。表l:化合物(3p,23S)-3-hydroxydammar-20,24國dien-21-oicacid21，23誦lactone的NMR數據(500MHz，CDC13)tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage94.化合物的細胞毒活性測定化合物的細胞毒活性測定採用MTT分析法測定。將乳腺管癌細胞(MDA-MB-435)用培養液配成單個細胞懸液(離心1000R,3-5min，重懸)，稀釋60000-70000個/ml，以每孔80ul接種到96孔板，6000個/孔，培養箱培養(5%C02，37°C)24小時，每孔加樣20ul。繼續培養72小時後，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配)10ul。振蕩10分鐘，使結晶物充分融解。繼續孵育3小時，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對於懸浮細胞需要離心後再吸棄孔內培養上清液。8-12小時後，選擇570nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。用下列公式計算IC5。(抑制率50%的時候藥物的濃度)抑制率=1_加藥組OD值/對照組OD值;lgIC5。=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)。其中，Xm:lg為最大劑量；I:lg(最大劑量/相臨劑量)；P:陽性反應率之和；Pm:最大陽性反應率；Pn:最小陽性反應率。結果得到該化合物對乳腺管癌細胞(MDA-MB-435)的IC5。為3.9|ug/ml。綜上所述，從絞股藍總皂甙酸水解產物中分離的化合物(3P，23S)-3-hydroxydammar-20，24-dien-21-oicacid21，23-lactone，對乳腺管癌細胞(MDA-MB-435)具有細胞毒活性，IC^為3.9pg/ml。該化合物為一種新的化合物，其分子式為C3GH4603，分子量為454。權利要求1.絞股藍總皂甙酸水解產物中分離的化合物，特徵在於，該化合物的結構式為該化合物的名稱為(3β，23S)-3-hydroxydammar-20，24-dien-21-oicacid21，23-lactone，分子式為C30H46O3，分子量為454。2.權利要求1所述的絞股藍總皂甙酸水解產物中分離的化合物的分離方法，其特徵在於，按如下步驟進行1)絞股藍總皂甙的水解取300g絞股藍總皂甙，溶解在5000ml的乙醇中，然後加入500ml鹽酸，6(TC水浴回流8小時，減壓濃縮揮幹乙醇，通過大孔樹脂柱，樹脂柱先用大量的水洗，再用80%的乙醇洗脫，收集80%的乙醇洗脫液濃縮得到80g水解產物；2)水解產物的分離純化水解產物通過矽膠柱層析、凝膠柱層析、反相柱層析分離提取其中的化學成分，常壓柱層析採用溼法裝柱和矽膠拌樣上柱，根據薄層展開情況選擇洗脫溶劑系統，反相柱層析採用加壓裝置，凝膠柱層析選用SephadexLH-20，多次柱層析，最後得到化合物(3P，23S)-3-hydroxydammar-20，24-dien-21-oicacid21，23-lactone。3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述水解產物的水解條件為:HCl/EtOHl:10，6(TC加熱反應8小時。4.權利要求1所述的絞股藍總皂甙酸水解產物中分離的化合物用於製備抗癌藥物的應用。全文摘要本發明公開了一種絞股藍總皂甙酸水解產物中分離的化合物，該化合物的結構式為右式，命名為(3β，23S)-3-hydroxydammar-20，24-dien-21-oicacid21，23-lactone，分子式為C30H46O3，分子量為454。經申請人所進行的鑑定以及細胞毒活性試驗證明，該化合物對乳腺管癌細胞(MDA-MB-435)具有細胞毒活性，能夠用於製備抗癌藥物的應用。文檔編號C07J19/00GK101463062SQ200910020910公開日2009年6月24日申請日期2009年1月15日優先權日2009年1月15日發明者張鞍靈,楊勝祥,白明生,秦建春,高錦明申請人:西北農林科技大學