人胚皮層神經幹細胞的分離培養方法
2023-07-24 19:48:41 1
專利名稱：人胚皮層神經幹細胞的分離培養方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種人胚皮層神經幹細胞的分離培養方法。
技術背景
神經幹細胞的發現是神經科學領域的重大突破，為神經發育和神經組織移植等研究領域開闢了廣闊前景。神經幹細胞是一種具有自我更新及廣泛分化潛能的細胞，它處於分化的非終末狀態，可通過對稱或不對稱分裂出新的幹細胞或分化潛能逐漸變小的子細胞，最終產生中樞神經系統的三種主要細胞，即神經元細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。一般認為神經幹細胞主要存在於哺乳動物胎腦的紋狀體、小腦半球、腦室區等，成年哺乳動物腦的側腦室壁和海馬等區。有關哺乳動物胚胎階段和成年動物在特定腦區存在神經幹細胞已不斷得到證實，但對人類神經幹細胞的研究尚少。發明內容
從人胚皮層中分離培養並鑑定神經幹細胞利用無血清培養和單細胞克隆技術在人胚皮層中分離具有單細胞克隆能力的細胞，並進行培養、傳代，貼壁分化觀察，採用間接免疫螢光檢測克隆細胞的神經巢蛋白(Nestin)抗原和分化後特異性成熟神經細胞抗原的表達。
具體的，為實現本發明的目的，所述的人胚皮層神經幹細胞的分離培養方法包括以下步驟
Sl 原代細胞的分離和培養取胚齡12周水囊引產的新鮮人胚胎，在無菌條件下分離出胎腦大腦皮層，剝離硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1 1)的細胞培養液中漂洗三次，用細吸管反覆吹打瓶內組織碎塊至完全散開，製成細胞懸液，經100目不鏽鋼網過濾， 製成單細胞懸液，經分胎藍染色計數活細胞加入含化7和bFGF的DMEM/F12無血清培養基， 調整細胞含量為1 X IO51Iir1，將細胞懸液分裝於25ml細胞培養瓶，每瓶3ml，37°C，5 % CO2條件下靜置培養7天。
S2 傳代培養及單細胞克隆、傳代將原代培養7天後的細胞克隆懸液用吸管輕柔吹打進行機械分離，製成單細胞懸液，用含化7和bFGF的無血清培養液將細胞懸液按 IXIOW濃度傳代接種於培養瓶，在37°C，5% CO2條件下靜置培養7天，同時進行克隆形成實驗，計數每代的克隆形成率，每7-9天機械分離傳代，方法同前。採用有限稀釋法，將原代克隆細胞製成的單細胞懸液，稀釋到40Π1Γ1，於96孔培養板中滴加稀釋的細胞懸液，選取僅有一個細胞的培養孔作記號，並動態觀察。待長成單細胞克隆球後機械分離成單細胞懸液，再將一個克隆的所有細胞種至培養瓶中，待次代克隆長成後連續傳代，最後得到大量來自某單個細胞的亞克隆。
S3 克隆誘導分化分別選取部分傳代及單細胞克隆的細胞種植於多個多聚賴氨酸包被的玻片上，並加入含血清培養基(DMEM/F12/B27/bFGF+5 %胎牛血清)，觀察其生長分化情況，分別於7天、14天行免疫螢光檢測。
S4 間接免疫螢光檢測將克隆細胞滴至多聚賴氨酸包被的玻片上，貼壁12小時後用4%多聚甲醛固定，行Nestin抗體免疫螢光染色(抗Nestin IgG)。分別將傳代及單細胞克隆的細胞種植於預置多聚賴氨酸包被玻片的含血清培養集中，於7天、14天時取出， 進行Nestin、NeuN, GFAP, CNP抗體的免疫螢光單標染色及NeuN和CNP抗體的免疫螢光雙標染色。
本發明採用無血清培養和單細胞克隆技術從從胚齡12周的新鮮人胚皮層中成功建立一株人胚神經幹細胞，該細胞具有連續克隆能力，可傳達培養，表達神經巢蛋白抗原。 分化後的細胞表達神經元細胞、膠質細胞和少突膠質細胞的特異性抗原。
通過下面結合附圖的詳細描述，本發明前述的和其他的目的、特徵和優點將變得顯而易見。其中
圖1所示為本發明的人胚皮層神經幹細胞的分離培養方法的步驟流程圖。
具體實施方式
如圖1所示的本發明的人胚皮層神經幹細胞的分離培養方法的步驟流程圖，所述方法包括以下步驟
Sl 原代細胞的分離和培養取胚齡12周水囊引產的新鮮人胚胎，在無菌條件下分離出胎腦大腦皮層，剝離硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1 1)的細胞培養液中漂洗三次，用細吸管反覆吹打瓶內組織碎塊至完全散開，製成細胞懸液，經100目不鏽鋼網過濾， 製成單細胞懸液，經分胎藍染色計數活細胞加入含化7和bFGF的DMEM/F12無血清培養基， 調整細胞含量為1 X IO51Iir1，將細胞懸液分裝於25ml細胞培養瓶，每瓶3ml，37°C，5 % CO2條件下靜置培養7天。
S2 傳代培養及單細胞克隆、傳代將原代培養7天後的細胞克隆懸液用吸管輕柔吹打進行機械分離，製成單細胞懸液，用含B27和bFGF的無血清培養液將細胞懸液按 IXIOW濃度傳代接種於培養瓶，在37°C，5% CO2條件下靜置培養7天，同時進行克隆形成實驗，計數每代的克隆形成率，每7-9天機械分離傳代，方法同前。採用有限稀釋法，將原代克隆細胞製成的單細胞懸液，稀釋到40Π1Γ1，於96孔培養板中滴加稀釋的細胞懸液，選取僅有一個細胞的培養孔作記號，並動態觀察。待長成單細胞克隆球後機械分離成單細胞懸液，再將一個克隆的所有細胞種至培養瓶中，待次代克隆長成後連續傳代，最後得到大量來自某單個細胞的亞克隆。
S3 克隆誘導分化分別選取部分傳代及單細胞克隆的細胞種植於多個多聚賴氨酸包被的玻片上，並加入含血清培養基(DMEM/F12/B27/bFGF+5 %胎牛血清)，觀察其生長分化情況，分別於7天、14天行免疫螢光檢測。
S4 間接免疫螢光檢測將克隆細胞滴至多聚賴氨酸包被的玻片上，貼壁12小時後用4%多聚甲醛固定，行Nestin抗體免疫螢光染色(抗Nestin IgG)。分別將傳代及單細胞克隆的細胞種植於預置多聚賴氨酸包被玻片的含血清培養集中，於7天、14天時取出， 進行Nestin、NeuN, GFAP, CNP抗體的免疫螢光單標染色及NeuN和CNP抗體的免疫螢光雙標染色。
實驗結果與分析
1.克隆細胞形態觀察人胚皮層原代培養細胞成圓形球狀，懸浮生長，經分胎藍染色計數活細胞在80 %以上，培養7天時細胞數目明顯增加，可見數十個至數萬個細胞組成的細胞球，細胞形態規則，邊界清楚，折光性強。有少數細胞貼壁生長，分化出有突起的神經原細胞，經傳代克隆後仍未出現與原代培養相同的大量次代克隆。單細胞克隆顯示單個細胞在培養3天時細胞克隆增大至數十個，此後隨密度增加生長加快，經傳代後仍成懸浮生長，細胞形態不變。
2.誘導分化結果將傳代克隆及單細胞克隆後獲得的克隆細胞經胎牛血清培養 12h後即見部分克隆細胞團向四周發出放射狀細胞索，2天後可見大部分細胞貼壁生長，形態不規則，細胞索不斷增粗和伸長，一周後大部分細胞已從其邊緣向外遷移分化成大量形態不一的、分散成片的多突起星狀細胞或神經原樣細胞，突起互相交織成網狀，2周後部分神經細胞開始衰退、死亡。
3.間接免疫螢光檢測將原代、傳代和單細胞克隆的細胞進行Nestin免疫螢光染色，結果顯示大部分細胞呈Nestin抗原陽性，尤其是傳代3次以上的克隆90%以上均呈陽性。NeuN免疫螢光染色呈陰性。經含血清培養7天、14天行NeuN、GFAP和CNP免疫螢光單標染色顯示均有陽性表達細胞存在，NeuN、GFAP和CNP雙標染色證實有神經元細胞和膠質細胞同時存在。Nestin免疫螢光染色在7天時尚可見部分陽性細胞，2周時幾乎未找到 Nestin陽性細胞。
本發明並不局限於所述的實施例，本領域的技術人員在不脫離本發明的精神即公開範圍內，仍可作一些修正或改變，故本發明的權利保護範圍以權利要求書限定的範圍為準。
權利要求
1. 一種人胚皮層神經幹細胞的分離培養方法，其包括以下步驟51原代細胞的分離和培養取胚齡12周水囊引產的新鮮人胚胎，在無菌條件下分離出胎腦大腦皮層，剝離硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1 1)的細胞培養液中漂洗三次，用細吸管反覆吹打瓶內組織碎塊至完全散開，製成細胞懸液，經100目不鏽鋼網過濾，製成單細胞懸液，經分胎藍染色計數活細胞加入含B27和bFGF的DMEM/F12無血清培養基，調整細胞含量為1 X IO51Iir1，將細胞懸液分裝於25ml細胞培養瓶，每瓶3ml,37°C,5% CO2條件下靜置培養7天；52傳代培養及單細胞克隆、傳代將原代培養7天後的細胞克隆懸液用吸管輕柔吹打進行機械分離，製成單細胞懸液，用含化7和bFGF的無血清培養液將細胞懸液按1 X IO41Iir1 濃度傳代接種於培養瓶，在37°C，5% CO2條件下靜置培養7天，同時進行克隆形成實驗，計數每代的克隆形成率，每7-9天機械分離傳代，方法同前；採用有限稀釋法，將原代克隆細胞製成的單細胞懸液，稀釋到40Π1Γ1，於96孔培養板中滴加稀釋的細胞懸液，選取僅有一個細胞的培養孔作記號，並動態觀察；待長成單細胞克隆球後機械分離成單細胞懸液，再將一個克隆的所有細胞種至培養瓶中，待次代克隆長成後連續傳代，最後得到大量來自某單個細胞的亞克隆；53克隆誘導分化分別選取部分傳代及單細胞克隆的細胞種植於多個多聚賴氨酸包被的玻片上，並加入含血清培養基(DMEM/F12/B27/bFGF+5%胎牛血清)，觀察其生長分化情況，分別於7天、14天行免疫螢光檢測；54間接免疫螢光檢測將克隆細胞滴至多聚賴氨酸包被的玻片上，貼壁12小時後用 4%多聚甲醛固定，行Nestin抗體免疫螢光染色(抗Nestin IgG)；分別將傳代及單細胞克隆的細胞種植於預置多聚賴氨酸包被玻片的含血清培養集中，於7天、14天時取出，進行 Nestin, NeuN, GFAP, CNP抗體的免疫螢光單標染色及NeuN和CNP抗體的免疫螢光雙標染色。
全文摘要
本發明提出一種人胚皮層神經幹細胞的分離培養方法，其包括以下步驟原代細胞的分離和培養；傳代培養及單細胞克隆、傳代；克隆誘導分化；以及間接免疫螢光檢測。本發明採用無血清培養和單細胞克隆技術從從胚齡12周的新鮮人胚皮層中成功建立一株人胚神經幹細胞，該細胞具有連續克隆能力，可傳達培養，表達神經巢蛋白抗原。分化後的細胞表達神經元細胞、膠質細胞和少突膠質細胞的特異性抗原。
文檔編號C12N5/0735GK102533636SQ20111044787
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者陸華 申請人:陸華