檢測抗生素耐藥細菌的方法和試劑盒的製作方法

2023-07-25 04:11:41

專利名稱：檢測抗生素耐藥細菌的方法和試劑盒的製作方法
檢測抗生素耐藥細菌的方法和試劑盒本發明涉及引起細菌碳青黴烯耐藥性(即碳青黴烯耐藥菌)的碳青黴烯酶基因的檢測方法和試劑盒。本發明還涉及可用於所述檢測的寡核苷酸引物。對β -內醯胺抗生素、例如青黴素和頭孢菌素(kefalosporins)耐藥性的增加，提出了由革蘭氏陰性桿菌引起的感染的治療問題。因而，必須越來越經常用廣譜抗生素替換 β-內醯胺抗生素。碳青黴烯代表了治療難治性醫院感染的重要的廣譜抗生素類別。碳青黴烯通常對最需氧的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌以及對厭氧菌有效。經常使用的碳青黴烯是亞胺培南、美羅培南和厄他培南。住院患者，特別是希臘、以色列、美國、土耳其和遠東(中國)以及中美洲的住院患者，都出現了對這些藥物耐藥的菌株。對碳青黴烯敏感性降低的典型細菌是大腸桿菌(E. coli)、克雷伯氏菌屬 (Klebsiella sp.)及其他腸桿菌屬(Enterobacteriaceae sp.)。此外，銅綠假單胞菌和它在環境源中密切相關的菌種，以及患者中存在的危害免疫應答的不動桿菌屬 (Acinetobacterium sp.)，經常對碳青黴烯的敏感性降低。對碳青黴烯抗生素的敏感性降低可以由上百個不同的β -內醯胺抗生素耐藥性基因中的一個或多個與細胞壁滲透性改變(例如特定的孔蛋白改變)和/或與ampCii-內醯胺酶的過量生產有關的主動流出相結合而引起。這通常引起碳青黴烯敏感性降低，這種降低經常是可逆的，當抗生素治療結束時終止。對此的原因在於該機制的維持對細菌是耗能的，並對它的營養供應不利。碳青黴烯耐藥性的另一種並且更重要的原因是降解碳青黴烯抗生素的酶，稱為碳青黴烯酶。與野生型細菌相比較，在碳青黴烯酶存在下，細菌不需要費大力進行競爭。因此， 碳青黴烯酶單獨就可以是顯著的碳青黴烯耐藥性的原因。這種機制可以與前面提到的機制組合出現，增加了敏感性降低和隨之而來的耐藥性。碳青黴烯酶基因可以存在於染色體中和質粒中。特別是位於質粒中的那些基因，容易轉移到其它菌種中，例如在廣譜β-內醯胺酶(ESBL)菌株中的那些基因。產生碳青黴烯酶的菌株往往也是ESBL-菌株。尤其是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)碳青黴烯酶(KPC)-和 Verona imipenemase (VIM)-基因家族對現行的抗生素治療是潛在的威脅。因為KPC-生產菌可能難以基於常規的抗菌素敏感試驗檢測到，所以它們可能在感染控制措施中造成問題。另一種常見的具有碳青黴烯酶性質的β -內醯胺酶家族是Guiana超廣譜β -內醯胺酶(GES)，它也特別難以基於常規抗菌素敏感試驗來測到。碳青黴烯耐藥基因在環境物種中的大貯備結合碳青黴烯日益增加的應用，激起了可能一直末被檢出的罕見或新的碳青黴烯酶基因出現的風險。另一方面，碳青黴烯耐藥性可以由如上所述的可逆的機制所引起。因此，需要有改進的方法來檢測生物樣品中引起碳青黴烯耐藥菌的碳青黴烯酶基因。概要本發明的目的是解決現有技術的至少一部分問題。具體而言，本發明的目的是提供查明生物樣品是否包含對碳青黴烯抗生素類型耐藥的細菌的方法。
更具體說，本發明的目的是提供引起細菌碳青黴烯耐藥性、即引起對碳青黴烯類型抗生素耐藥性的碳青黴烯酶基因的篩查方法。
本發明是基於應用分子生物學方法從生物樣品中篩查耐藥基因。具體而言，本發明是基於應用專門設計的、能夠檢測引起碳青黴烯耐藥性的碳青黴烯酶基因的引物。這些方法可用於代替生化方法或與其結合。
本發明提供存在於生物樣品的細菌(碳青黴烯耐藥菌)中引起碳青黴烯耐藥性的碳青黴烯酶基因的檢測方法。
本發明還提供了鑑定碳青黴烯酶基因的試劑盒和引物。
此外，本發明提供鑑定碳青黴烯酶基因的裝置。本發明具有許多優點。它使得可以迅速鑑定威脅醫院保健和連續隨訪的菌株。而這通過使用生化方法只有部分可能。單獨或與生化方法結合應用分子生物學方法顯著改進了現有技術。
在下文中，將藉助於具體說明並參考一些工作實施例，更密切地查驗本發明。


圖1顯示了四種不同碳青黴烯酶基因的基因擴增曲線。
圖2顯示了解鏈曲線分析，不同的基因產物可以基於它們的不同解鏈溫度而分開。
發明的具體說明
本發明使得有可能篩查對碳青黴烯抗生素耐藥的基因。所述方法基於檢測引起細菌碳青黴烯耐藥性的碳青黴烯酶基因。更具體地說，所述篩查基於應用擴增方法，例如 LCR(連接酶鏈反應)或PCR(聚合酶鏈反應)方法。
優選，擴增反應是PCR方法，具體是實時PCR。更有利的是，所述方法基於實時STOR Green檢測來應用PCR並優選產物的解鏈曲線分析。
SYBR Green在此是指核酸結合性螢光染料發光擴增產物帶有與其結合的核酸結合性螢光染料，所述螢光染料以選定的光波長從其引發螢光，並監測螢光發射，當所述螢光發射達到平臺階段表明反應完成時，確定周期。優選，所述核酸結合性螢光染料是選自 SYBR. TM. GREEN I、溴化乙錠、pico green、EVA GREEN、吖啶橙、噻唑橙、Y0-PR0-1 和色黴素 A3的成員。
實時STOR Green檢測在此是指生物樣品中靶核酸序列的聚合酶鏈反應擴增的實時監測方法。所述方法包括通過聚合酶鏈反應、優選在STOR. TM. Green I存在下擴增靶序列，所述聚合酶鏈反應包括以下步驟向生物樣品添加針對靶核酸序列的熱穩定的聚合酶和引物，在至少變性溫度和延伸溫度之間熱循環所述生物樣品；用被所述STOR. TM. Green I 吸收的波長的光激發所述生物樣品和檢測從所述生物樣品的發射光；以及監測來自STOR. TM. Green I的溫度依賴性螢光。優選，所述監測步驟包括確定擴增的靶序列的解鏈曲線圖。
「生物樣品」在此是指直接臨床樣品，例如體液諸如血液或尿、或喉拭子、鼻拭子、 皮膚拭子、痰、糞便或支氣管吸出物。生物樣品還可以是指來自各種環境的細菌的純培養物。細菌培養物典型可以通過鋪板和生長細菌從生物樣品製備。
擴增反應，典型是PCR反應，可用於直接擴增生物樣品中或細菌的純培養物中的核酸，生物樣品在此典型是臨床樣品，或者擴增反應，典型是PCR反應可用於擴增分離的核酸。
「引物」在此是指設計成特異性針對待檢測的多核苷酸的寡核苷酸。引物可以被設計成包含或具有與靶多核苷酸序列互補的序列。可以設計能夠通過與靶多核苷酸鹼基配對進行雜交的正向和反向引物。在本發明的一種實施方案中，引物被設計成檢測預期引起碳青黴烯耐藥性的碳青黴烯酶基因。在本發明的優選實施方案中，所述引物包含至少部分或者包含或具有選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 49的序列。
引物優選長度為15至50個核苷酸，典型長度為20至40、或20至35個核苷酸。 可以在引物的任一端或兩端加上附加的核苷酸，例如1、2或3個核苷酸。或者，可以從引物的任一端或兩端缺失或取代1、2或3個核苷酸。在一些情況下，可以在中間、即引物的末端部分以外的部分中添加、缺失或取代1、2或3個核苷酸。
修飾(特別是遺傳修飾)引物的部分序列是可能的，只要所述引物與靶核酸序列具有足夠互補性、能夠與所述靶核酸序列雜交即可。修飾的引物或引物的部分序列，如果其仍然能夠檢測靶多核苷酸序列、即造成碳青黴烯耐藥性的基因碳青黴烯酶基因，則屬於本發明範圍內。
雜交條件優選是嚴緊條件，在此是指在58°C +/_7°C、優選+/_3°C下雜交。試驗可以使用含有對引物雜交(在PCR的情況下為退火)和延伸反應最適宜的離子濃度、例如Mg2+、K+和NH4+的商業PCR主混合物來運行。例如，MAXIMA SYBR qPCR主混合物為了 PCR效率高使用了低量的STOR Green0反應中的組分是10微升qPCR主混合物、6. 8微升 oligomix 1、或 6. 4 微升 oligomix 2、和 1 微升 DNA 模板。
只使用生化方法不可能解決碳青黴烯耐藥性背後的遺傳機制，因為所述耐藥性由超過110個基因所引起。對耐藥性機制的認識極大改善了抗生素敏感性分析的判讀和用於治療患者的藥物選擇。例如，具有廣泛的底物譜的碳青黴烯酶，例如VIM，阻礙了任何β-內醯胺抗生素的體內應用，而其它機制，例如ΙΜΙ，留下了一些可用的β -內醯胺治療選擇。
本公開內容提供了引物，其已被設計成檢測造成碳青黴烯耐藥性的基因(即碳青黴烯酶抗性的碳青黴烯酶基因)。所述引物已經過試驗檢驗和優化。根據本發明的一個優選實施方案，在兩個分開的反應中執行鑑定反應。在這些反應中，擴增條件通常是相容的。 這使得可以進行HTP篩查(高通量篩查)。
因此，本方法使得測試成本有可能最小化。本方法也是簡單的和用戶友好的。此外，本方法適於日常的診斷應用。
根據本發明的優選實施方案，本試驗可以鑑定110個耐藥基因以及它們的亞變體。這優選在基於實時STOR Green為基礎的鑑定和測定解離溫度的兩個(或更多，優選兩個)多重PCR反應中進行。
根據本發明的一個優選實施方案，一個(或第一個)多重反應覆蓋腸細菌 (Enterobacteriaceae)內99%以上的碳青黴烯酶。通過使用第一個多重反應，有可能篩查屬於腸細菌的大腸桿菌。
根據本發明的另一種優選實施方案，另一個(第二個)多重反應的具體目的是篩查免疫受損患者的多重耐藥菌。這些典型是屬於假單胞細菌屬O^eudomonas sp.)和 Acinetobacterium sp.的細菌。
根據另一個實施方案，一個(或第一個)多重反應典型檢測B群金屬-β-內醯胺酶基因、大多數A群碳青黴烯酶基因(青黴素酶基因)和屬於D群(苯唑西林酶)的0ΧΑ-48基因。另一個(或第二個)多重反應典型檢測D群碳青黴烯酶基因(苯唑西林酶基因)、C 群碳青黴烯酶基因(頭孢菌素酶基因)以及屬於A群(青黴素酶)的SFC基因和NMD-I。
根據本發明的一個優選實施方案，所述方法包括以下步驟
1和2.製備生物樣品。
這可以包括分離核酸。其典型通過煮沸或由提取機器人半自動執行。樣品也可以直接使用或可以使用從樣品製備的細菌純培養物。
3.基因擴增
a)包含聚合酶和PCR緩衝液的主混合物；
b)核苷三磷酸單體；
c)反應的寡核苷酸引物；
d)來自樣品的核酸模板；
e)擴增和分析產物的解離曲線。這優選通過實時PCR設備執行。
4.結果分析
a)介紹陽性和陰性對照；
b)解離溫度往往表明機制；如果需要，結果可以通過在另外的反應中對產物測序來驗證；
c)陰性結果排除了具有高概率的碳青黴烯酶，因為所述試驗基本包括臨床菌種中公開的所有碳青黴烯酶基因。
從樣品和核酸模板分離的核酸優選是DNA。
因為大多數樣品是陰性的，所以所述篩查方法在非常有效並且性質上是高通量的。
在本發明優選的實施方案中，寡核苷酸引物被設計用於檢測選自下列的基因或基因家族或基因亞變體
VIM 1-22、MP 1-24、OXA-48、KPC 1-7,GES 1-10、SPM、NMC-A、IMI 1-3,SME 1-3、 GIM-I、和 SM-I。
根據更優選的實施方案，在一個反應中檢測各基因或基因家族中的至少一個。在更加的優選實施方案中，在一個反應中檢測一個以上基因或基因家族或者一個以上基因亞變體或者所有基因或基因家族或基因亞變體。
在本發明的另一種優選實施方案中，寡核苷酸引物被設計用於檢測選自下列的基因或基因家族或它們的亞變體
0XA-24、-25、26、-40、-72、0XA-23、-27、0XA-50、0XA-51、64-66、68-71、75-78、83、 84、86-89、-92、-94、-95、0XA-55、0XA-58、0XA-60、0XA-62、SFC-1、和 CMY-1、-10。
根據更優選的實施方案，在一個反應中檢測各基因或基因家族中的至少一個。在更加的優選實施方案中，在一個反應中檢測一個以上基因或基因家族或者一個以上基因亞變體或者所有基因或基因家族或基因亞變體。
根據更優選的實施方案，在一個反應中檢測各OXA基因或基因家族中的至少一個，更優選在一個反應中檢測一個以上基因或基因家族或者一個以上基因亞變體或者所有 OXA基因或基因家族或基因亞變體。
在本發明的另一種優選實施方案中，寡核苷酸引物被設計用於檢測選自下列的基因或基因家族或它們的亞變體
OXA-48、SME、GIM-U VIM 1-22、SPM、GES 1-10, KPC 1-7、IMI 1-3/NMC-A、IMP 1-24。
根據更優選的實施方案，在一個反應中檢測各基因或基因家族中的至少一個。在更加的優選實施方案中，在一個反應中檢測一個以上基因或基因家族或者一個以上基因亞變體或者所有基因或基因家族或基因亞變體。
在本發明的另一種優選實施方案中，寡核苷酸引物被設計用於檢測選自下列的基因或基因家族或它們的亞變體
0XA-23 群、0ΧΑ-Μ 群、具有 ISabal 啟動子的 0XA-51 群、0XA-55、0XA-58、0XA-60、 0XA-62、CMY 1、-10、-11、SFC-I、NDM-I 和 SIM-I0
根據更優選的實施方案，在一個反應中檢測各基因或基因家族中的至少一個。在更加的優選實施方案中，在一個反應中檢測一個以上基因或基因家族或者一個以上基因亞變體或者所有基因或基因家族或基因亞變體。
NDM-I是來自印度和巴基斯坦的新的金屬-β -內醯胺酶(MBL)，其與其它MBL的同一性非常少，最類似的MBL是VIM-1/VIM-2，與它只有32. 4%同一性。NDM-I可以水解除了氨曲南以外的所有-β -內醯胺。與VIM-2相比，NDM-I表現出與大多數頭孢菌素特別是頭孢呋肟、頭孢噻肟、頭孢金素(頭孢噻吩)以及與青黴素的結合更緊密。NDM-I可以通過轉接合質粒介導，與其它細菌菌種在體內接合。
儘管通過研究許多碳青黴烯酶基因的存在，可以獲得生物樣品中碳青黴烯酶抗性的大多數可靠結果，但要檢測的最重要的基因(或基因家族或基因亞變體)選自KPC 1-7、 OXA-48, VIM 1-22, GES 1-10、和/或IMPlH要檢測的最重要的是KPC 1-7，第二重要的是0XA-48和/或VIM 1-22，第三重要的是GES 1_10，第四重要的是IMP 1_24。
此外，要檢測的重要的還有以下基因(或基因家族或基因亞變體)SME 1-3、 GIM-I、SPM 和 / 或 IMI1-3/NMC-A。
要檢測的重要的還有以下基因(或基因家族或基因亞變體):0XA-23群、0XA-24 群、具有ISabal啟動子的0XA-51群、0XA-58和/或NDM-I。此外，要檢測的重要的還有 CMY-1、-10、-11、SFC-1和/或SIM-I基因(或基因家族或基因亞變體)。還可以檢測0XA-55、 0XA-60和/或0XA-62基因(或基因家族或基因亞變體)。
但是，哪種基因是檢測最重要的還取決於地理區域，即某些耐藥基因和/或細菌在那個地理區域的發生率。
所有上述基因已經在文獻中描述。除了陽性對照菌株之外，試驗還驗證了 250種以上臨床ESBL菌株，其中50種以上多重耐藥不動桿菌-和假單孢菌菌株與大約60種其它陰性對照菌株(特異性)涵蓋了最重要的臨床需氧桿菌。
在本發明的一種實施方案中，寡核苷酸優選具有或包含以下序列
權利要求
1.檢測生物樣品中碳青黴烯酶基因的方法，其包括以下步驟-在來自生物樣品的核酸模板和引物的存在下進行擴增反應，所述引物長15至50個核苷酸並至少部分具有或者包含選自SEQ ID NOS 15和16、和/或1或49和2、和/或9和 10、和/或13和14、和/或19、20、21和22的核苷酸序列或其修飾序列；-分析產物的解離曲線，和-確定KPC、OXA-48、VIM、GES和/或IMP基因的一個或多個或它們造成碳青黴烯耐藥性的亞變體的存在，表明所述生物樣品包含引起細菌碳青黴烯耐藥的碳青黴烯酶基因。
2.權利要求1的方法，其中所述方法還包含下述引物，所述引物長15至50個核苷酸並至少部分具有或包含選自SEQ ID NOS :3、4、5、6、7、8、11、12、17和18的核苷酸序列或其修飾序列，用於確定SME、GIM-I、SIM-I、SPM和/或IMI/NMC-A基因的一種或多種或它們的亞變體的存在。
3.權利要求1的方法，其中所述方法還包含下述引物，所述引物長15至50個核苷酸並至少部分具有或包含選自SEQ ID NOS :3、4、5、6、11、12、17和18的核苷酸序列或其修飾序列，用於確定SME、GIM-I、SPM和/或IMI/NMC-A的一種或多種的存在。
4.權利要求1至3任一項的方法，其中所述方法還包含下述引物，所述引物長15至 50個核苷酸並至少部分具有或者包含選自SEQ ID NOS :23、24、25、26、27、28、四、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41和42的核苷酸序列或其修飾序列，用於確定0XA-24、 25、26、-40、-72、0XA-23、-27、0XA-50、0XA-51、64-71、75-78、83、84、86_89、-92、-94、-95、 0XA-55、0XA-58、0XA-60、0XA-62、SFC-1、和 / 或 CMY-1_10、-11 基因中的一種或多種或它們的亞變體的存在。
5.權利要求1至3任一項的方法，其中所述方法還包含下述引物，所述引物長15至 50個核苷酸並至少部分具有或者包含選自SEQ ID NOS :25、26、43、44、45、46、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、47和48的核苷酸序列或其修飾序列，用於確定0XA-23 群、0XA-24 群、具有 ISabaI 啟動子的 0XA-51 群、0XA-55、0XA-58、0XA-60、0XA-62、 CMY-U-10,-IU SFC-I、NDM-I和/或SIM-I基因的一種或多種或它們的亞變體的存在。
6.權利要求1至5任一項的方法，其中所述反應在具有共同相容的擴增條件的兩個或更多個分開的多重反應上進行。
7.試劑盒，其包含用於鑑定引起細菌碳青黴烯耐藥性的碳青黴烯酶基因的一組引物對，所述引物長15至50個核苷酸並至少部分具有或包含選自SEQ ID NOS 15和16、1或49 和2、9和10、13和14、和/或19、20、21和22的核苷酸序列或其修飾序列，用於確定KPC、 OXA-48、VIM、GES和/或IMP基因的一種或多種或它們的亞變體的存在。
8.權利要求7的試劑盒，其中所述試劑盒還包含下述引物，所述引物長15至50個核苷酸並至少部分具有或包含選自SEQ ID NOS :3、4、5、6、7、8、11、12、17和18的核苷酸序列或其修飾序列，用於確定SME、GIM-I、SIM-I、SPM、IMI/NMC-A基因的一種或多種或它們的亞變體的存在。
9.權利要求7的試劑盒，其中所述試劑盒還包含下述引物，所述引物長15至50個核苷酸並至少部分具有或包含選自3、4、5、6、11、12、17和18的核苷酸序列或其修飾序列，用於確定SME、GIM-1、SPM、和/或IMI/NMC-A基因的一種或多種或它們的亞變體的存在。
10.權利要求7-9任一項的試劑盒，其中所述試劑盒還包含下述引物，所述引物長15至50個核苷酸並至少部分具有或者包含選23、24、25、26、27、28、四、30、31、32、33和；34、35、 36、37、38、39、40、41和42的核苷酸序列或其修飾序列，用於確定0XA_24、25、26、-40、-72、 0XA-23、-27、0XA-50、0XA-51、64-71、75-78、83、84、86-89、-92、-94、-95、0XA-55、0XA-58、 0XA-60、0XA-62、SFC-1、和/或CMY-1-10、-11基因中的一種或多種或它們的亞變體的存在。
11.權利要求7-9任一項的試劑盒，其中所述試劑盒還包含下述引物，所述引物長15至 50個核苷酸並至少部分具有或者包含選自25、26、43、44、45、46、31、32、33、34、；35、36、37、 38、39、40、41、42、47和48的核苷酸序列或其修飾序列，用於確定0XA-23群、0XA-24群、具有 ISabaI 啟動子的 0XA-51 群、0XA-55、0XA-58、0XA-60、0XA-62、CMY-U -10、-11、SFC-U NDM-I和/或SIM-I基因的一種或多種或它們的亞變體的存在。
12.用於鑑定碳青黴烯耐藥基因的寡核苷酸引物對，其中所述寡核苷酸長15至50個核苷酸並至少部分具有或者包含選自SEQ ID N0S: 15和16、和/或1或49和2、和/或9和 10、和/或13和14、和/或19、20、21和22的核苷酸序列或其修飾序列。
13.用於鑑定引起細菌碳青黴烯耐藥的碳青黴烯酶基因的裝置，其包含第一和第二個多重反應，其中在第一個多重反應中在單個反應內檢測選自KPC、OXA-48、VIM、GES和/或 IMP的基因、基因家族和/或基因亞變體中的一個或多個或全部；所述檢測通過使用引物進行，所述引物長15至50個核苷酸並至少部分具有或者包含選自SEQ ID N0S:15和16、和/ 或1或49和2、和/或9和10、和/或13和14、和/或19、20、21和22或其修飾序列的引物對。
14.權利要求13的裝置，其中在所述多重反應中在單個反應內進一步檢測選自SME、 GIM-USPM和/或IMI/NMC-A的基因、基因家族和/或基因亞變體中的一個或多個或全部， 所述檢測通過使用引物進行，所述引物長15至50個核苷酸並至少部分具有或者包含選自 SEQ ID NOS 3和4、和/或5禾口 6、和/或11禾口 12、和/或17禾口 18的引物對。
15.權利要求13或14的裝置，其中在第二個多重反應中在單個反應內檢測選自 0XA-23 群、0XA-24 群、具有 ISabaI 啟動子的 0XA-51 群、NDM-1、0XA-58、CMY、SFC-1 和 / 或 SIM-I的基因、基因家族和/或基因亞變體中的一個或多個或全部，所述檢測通過使用引物進行，所述引物長15至50個核苷酸並至少部分具有或者包含選自SEQ ID NOS : 和25、 和/或43和44、和/或45和46禾口 /或47和48、和/或33禾口 34、和/或39禾口 40、和/或 41和42和/或7和8、或其修飾序列的引物對。
全文摘要
本發明涉及引起細菌碳青黴烯耐藥性的碳青黴烯酶抗性基因的檢測方法和試劑盒。本發明提供可用於所述檢測的寡核苷酸引物。所述方法可用於在單個反應內檢測OXA-48、SME、GIM-1、VIM 1-22、SPM、GES 1-10、KPC 1-7、IMI 1-3/NMC-A、IMP 1-24，和在另一個單個反應內檢測OXA-23群、_OXA-24群、具有ISabaI啟動子的OXA-51群、OXA-55、OXA-58、OXA-60、OXA-62、CMY 1、-10、-11、SFC-1、NDM-1、和SIM-1。
文檔編號C12Q1/68GK102482712SQ201080021305
公開日2012年5月30日 申請日期2010年5月17日 優先權日2009年5月15日
發明者尤哈·科夫斯卡裡, 蘇維·克斯克拉 申請人:尤哈·科夫斯卡裡, 託馬斯·特坎恩