一種化學降解肝素及檢測肝素二糖組成的方法

2023-08-04 16:13:11

一種化學降解肝素及檢測肝素二糖組成的方法
【專利摘要】本發明屬於醫藥領域涉及一種化學降解肝素及檢測肝素二糖組成的方法，包括如下步驟：(1)將肝素脫乙醯化，得脫乙醯肝素；(2)將脫乙醯肝素用亞硝酸降解，得肝素二糖；(3)將肝素二糖用衍生試劑衍生；(4)用液相色譜(LC)法或液相色譜質譜聯用(LC-MS)法檢測步驟(3)所得衍生後的二糖。本發明化學降解法可將肝素完全降解為二糖，可以保存全部的糖醛酸信息，能夠準確並且完全地得到肝素二糖的結構信息；降解條件溫和，成本低，操作簡單，對實驗儀器要求低，適用範圍廣，適合多種肝素；檢測耗時短，樣品消耗量小，靈敏度高，分析結果重複性好。
【專利說明】—種化學降解肝素及檢測肝素二糖組成的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於醫藥領域涉及一種化學降解肝素及檢測肝素二糖組成的方法。
【背景技術】
[0002]肝素(Heparin)是一種由葡萄糖胺(GlcN)和糖醛酸((D-葡萄糖醛酸(GlcA)或L-艾杜糖醛酸(IdoA))為二糖重複單元組成的線性多糖硫酸脂，肝素分子量範圍一般在3-30kDa，平均分子量15kDa。它作為一種抗凝血、抗血栓生成的藥物在臨床上已經使用了70多年，迄今為止還沒有一種能夠完全代替肝素的抗凝血和抗血栓生成藥物。肝素還具有如抗炎、抗過敏、降血脂及抗動脈粥樣硬化、擴張冠脈、緩解支氣管筋攣、降低痰液的粘稠性、促進組織呼吸、抑制病毒活性、抗腫瘤轉移以及誘導幹擾素的產生等許多新的用途與功效。經研究發現，肝素抗凝血機理是通過催化抗凝血因子III (ATIII)、肝素輔助因子II等與多個凝血因子形成共價複合物以消除凝血酶活性來實現的。將肝素通過化學法、物理法或酶解法進一步降解可得到低分子肝素。低分子肝素具可皮下注射、出血可能性低、安全係數高等優點，所以目前低分子肝素是佔主導地位的肝素類藥物。肝素五糖——磺達肝癸鈉，是第一個人工合成的肝素五糖，是目前臨床使用的選擇性Xa凝血因子抑制劑。
[0003]我國是肝素的生產大國，提供全世界70%的肝素原料藥。2008年發生的汙染肝素事件是由肝素鈉中混有過硫酸化的類肝素導致的過敏反應引起，因此開發出簡單可靠、弓丨領世界的肝素二糖組成分析方法具有重大的理論與實際意義。
[0004]肝素的結構一般用二糖組成來描敘，其種IdoA2S_GlcNS6S是主要二糖，在豬腸黏膜肝素中這種二糖大約佔60-70 %，其他二糖有IdoA2S-GlcNS, IdoA-GlcNS6S,GlcA-GlcNS6S, GlcA_GlcNS3S，GlcA_GlcNS3S6S，GlcA-GlcNAc 等。現分析肝素二糖的傳統方法為酶法降解或亞硝酸降解，然後用液相色譜法(LC)或液相色譜質譜聯用法(LC-MS)分析，如專利CN201110241617公開了一種用肝素酶1、I1、III降解並用LC法分析依諾肝素。這三種酶具有不同的生物活性，可以切斷肝素類樣品中不同的糖苷鍵，將三者聯合使用，通過強陰離子交換柱分離酶解得到的各種二糖，與市售的二糖標準品比對保留時間進行定性，再通過各二糖標準品對檢測器響應值和物質量的標準曲線進行定量。專利CN200580009444公開了用肝素酶將肝素解聚後用LC分析。但是用酶降解肝素時，葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IdoA)脫水後形成結構相同的脫水的糖醛酸，從而失去了肝素中葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IdoA)的含量與結構信息，且肝素酶不能將肝素完全降解為二糖。肝素酶、強陰離子交換柱和二糖標準品都非常昂貴，並且酶容易失活，性質不穩定，檢測步驟繁瑣，樣品消耗量大，檢測時間長，分析結果的重複性差。用這種方法檢測汙染肝素，其中的過硫酸軟骨素或硫酸皮膚素不僅不能被相應的酶降解，還會抑制肝素酶活性。專利CN200910256076公開了亞硝酸鈉降解肝素的方法，亞硝酸降解法只能降解肝素中帶有N-硫酸基的葡萄糖胺，不能降解肝素中帶有N-乙醯基的葡萄糖胺或過硫酸軟骨素或硫酸皮膚素中帶有N-乙醯基半乳糖胺，因此只能得到部分二糖的結構信息。因此傳統的二糖分析方法已經不能滿足現在的需要，因此亟需一種能同時檢測肝素及類肝素汙染物的二糖組成分析方法。

【發明內容】

[0005]針對現有技術存在的不足，本發明提供一種全面、高效、簡單、穩定且成本低的化學降解肝素及類肝素汙染物並檢測其二糖組成的方法。
[0006]實現上述發明的技術方案是:
[0007]1.一種檢測肝素二糖組成的方法，包括如下步驟:
[0008](I)將肝素脫乙醯化，得脫乙醯肝素；
[0009](2)將脫乙醯肝素用亞硝酸降解，得肝素二糖；
[0010](3)將肝素二糖用衍生試劑衍生；
[0011]取步驟(2)所得肝素二糖濃縮至幹並完全溶解於水，然後調節pH值至鹼性，加入吡唑啉酮類衍生試劑，反應完成後用氯仿萃取三次去除未反應的衍生試劑；
[0012](4)用液相色譜(LC)法或液相色譜質譜聯用(LC-MS)法檢測步驟(3)所得衍生後
的二糖。
[0013]2如權利要求1所述的一種檢測肝素二糖組成的方法，步驟(I)所述的脫乙醯化反應步驟包括:
[0014]將肝素溶於含有N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加熱使其溶解，然後密封加熱到93-105 °C，反應2-16h，反應完成後，凍幹，除去N2H4得脫乙醯肝素。
[0015]3.如權利要求1所述的一種檢測肝素二糖組成的方法，步驟(I)所述的脫乙醯化反應步驟包括:
[0016]將肝素溶於含有N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加熱使其溶解，然後密封加熱到98 0C,反應4h,反應完成後,凍幹，除去N2H4得脫乙醯肝素。
[0017]4.如權利要求1所述的一種檢測肝素二糖組成的方法，步驟(2)所述的亞硝酸降解步驟包括:
[0018]將脫乙醯肝素濃縮至幹，溶於水中，加入pH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在0_5°C條件下反應，調節PH到4.0，加入pH為4.0的亞硝酸，在0-5°C條件下反應，加入氨水終止反
應，得肝素二糖。
[0019]本發明與現有技術相比具有以下優點:
[0020](I)本發明方法可將肝素完全降解為二糖，可以保存全部的糖醛酸信息。
[0021](2)化學降解條件溫和，成本低，操作簡單，對實驗儀器要求低。
[0022](3)適用範圍廣，適合肝素、原料肝素、低分子量肝素、肝素寡糖以及汙染肝素等多種肝素的檢測分析。
[0023](4)檢測耗時短，可以同時對多種樣品進行定量。
[0024](5)樣品消耗量小，靈敏度高，分析結果重複性好，檢測限為ng級別。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為肝素五糖化學降解所得二糖D8PMP衍生的LC圖譜。
[0026]圖2為低分子量肝素化學降解所得二糖PMP、D3PMP、D8PMP衍生的總離子流圖(A)和質譜圖⑶。[0027]圖3為肝素化學降解所得二糖PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生的總離子流圖(A)和質譜圖⑶。
[0028]圖4為肝素五糖化學降解所得二糖D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生的總離子流圖(A)和質譜圖⑶。
[0029]圖5為肝素和汙染肝素化學降解所得二糖的D3PMP和D8PMP衍生的總離子流圖(A)和質譜圖⑶。
[0030]圖6為肝素五糖化學降解所得二糖PMP、D3PMP衍生的總離子流圖(A)和質譜圖⑶。 [0031]圖7為原料肝素化學降解所得二糖D3NMP衍生的LC圖譜。
[0032]圖8為肝素五糖化學降解所得二糖NMP和D3NMP衍生的總離子流圖(A)和質譜圖⑶。
【具體實施方式】
[0033]實施例1-3肝素購自Sigma-Aldrich公司，產品編號H5515。
[0034]實例I肝素的化學降解
[0035](I)將Img肝素溶於500uL含有10% N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加熱使其溶解，然後密封加熱到98°C，反應4小時，反應完成後，凍幹，除去N2H4得脫乙醯肝素；
[0036](2)將步驟(1)所得脫乙醯肝素溶於50uL水中，加入50uLpH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在0-5°C條件下反應10min後調節pH到4.0，加入50uL pH為4.0的亞硝酸，在0_5°C條件下反應10min,加入30uL氨水終止反應。
[0037]實例2肝素的化學降解
[0038](I)將Img肝素溶於ImL含有10% N2H4 -H2SO4的N2H4.Η20溶液中，加熱使其溶解，然後密封加熱到93°C，反應16小時，反應完成後，凍幹，除N2H4得脫乙醯肝素；
[0039](2)將步驟(1)所得脫乙醯肝素溶於50uL水中，加入50uLpH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在0-5°C條件下反應10min後調節pH到4.0，加入50uL pH為4.0的亞硝酸，在0_5°C條件下反應10min,加入30uL氨水終止反應。
[0040]實例3肝素的化學降解
[0041](I)將Img肝素溶於ImL含有10% N2H4 -H2SO4的N2H4.Η20溶液中，加熱使其溶解，然後密封加熱到105°C，反應2小時，反應完成後，凍幹，除N2H4得脫乙醯肝素；
[0042](2)將步驟(1)所得脫乙醯肝素溶於50uL水中，加入50uLpH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在0-5°C條件下反應10min後調節pH到4.0，加入50uLpH為4.0的亞硝酸，在0_5°C條件下反應10min,加入30uL氨水終止反應。
[0043]對以上實施例的降解產物進行檢測，結果見表1。
[0044]表1化學降解產物分析

聚合度大於2的寡糖的比例
[0045]_
實例I?[0046]
【權利要求】
1.一種檢測肝素二糖的方法，其特徵在於，包括如下步驟: (1)將肝素脫乙醯化，得脫乙醯肝素； (2)將脫乙醯肝素用亞硝酸降解，得肝素二糖； (3)將肝素二糖用衍生試劑衍生 取步驟(2)所得肝素二糖濃縮至幹並完全溶解於水，然後調節pH值至鹼性，加入吡唑啉酮類衍生試劑，反應完成後用氯仿萃取三次去除未反應的衍生試劑； (4)用液相色譜(LC)法或液相色譜質譜聯用(LC-MS)法檢測步驟(3)所得衍生後的二糖。
2.如權利要求1所述的一種檢測肝素二糖的方法，其特徵在於，步驟(1)所述的脫乙醯化反應步驟包括: 將肝素溶於含有N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加熱使其溶解，然後密封加熱到93-105 °C，反應2-16h，反應完成後，凍幹，除去N2H4得脫乙醯肝素。
3.如權利要求1所述的一種檢測肝素二糖的方法，其特徵在於，步驟(1)所述的脫乙醯化反應步驟包括: 將肝素溶於含有N2H4 -H2SO4的N2H4 -H2O溶液中，加熱使其溶解，然後密封加熱到98°C，反應4h,反應完成後,凍幹，除去N2H4得脫乙醯肝素。
4.如權利要求1所述的一種檢測肝素二糖的方法，其特徵在於，步驟(2)所述的亞硝酸降解步驟包括: 將脫乙醯肝素濃縮至幹，溶於水中，加入PH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在0-5°C條件下反應，調節pH到4.0,加入pH為4.0的亞硝酸,在0-5°C條件下反應,加入氨水終止反應,得肝素二糖。
5.如權利要求1至4任意一項所述的一種檢測肝素二糖的方法，其特徵在於，步驟(I)所述的脫乙醯反應步驟中肝素與N2H4.H2O溶液的質量體積比(mg/mL)為1: 0.5-1，N2H4.H2O 溶液中含 10% N2H4.H2SO40
6.如權利要求1至4任意一項所述的一種檢測肝素二糖的方法，其特徵在於，步驟(2)所述的亞硝酸降解步驟中脫乙醯肝素水溶液與亞硝酸鈉水溶液、亞硝酸、氨水的體積比為1:1:1: 0.6。
7.如權利要求1至4任意一項所述的一種檢測肝素二糖的方法，其特徵在於，步驟(3)所述的肝素二糖與吡唑啉酮類衍生試劑的質量比為1: 6-60。
8.如權利要求1至4任意一項所述的一種檢測肝素二糖的方法，其特徵在於，步驟(3)所述的吡唑啉酮類衍生試劑包括1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3PMP)，1-氘代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(D5PMP)，1-氘代苯基_3_氘代甲基-5-吡唑啉酮(D8PMP)，1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3NMP)或1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)。
9.如權利要求1至4任意一項所述的一種檢測肝素二糖的方法，其特徵在於，步驟(3)所述的吡唑啉酮 類衍生試劑包括PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP中的一種或任意幾種聯用，D3NMP.NMP中的一種或兩種聯用。
10.如權利要求1至4任意一項所述的一種檢測肝素二糖的方法，其特徵在於，所述肝素包括從動物組織中提取的可用於臨床抗血凝的肝素多糖或肝素原料，經降解後平均分子量低於 肝素的低分子量肝素，肝素含量低於99%的汙染肝素或聚合度為5-8的肝素寡糖。
【文檔編號】G01N30/06GK103675144SQ201310695114
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】張麗娟, 韓章潤, 曾洋洋, 蘭瑩, 邱培菊 申請人:中國海洋大學